蜜蜂微孢子蟲對蜜蜂行為及生理機能的影響

劉楠楠 郝京玉 王 志 譯自《澳大利亞養蜂》2012年第7期

目前有兩種蜜蜂微孢子蟲可侵染美國西部的西方蜜蜂。第一個是Nosema apis，1909年被Zander首次描述。1995年，Ingmar Fries描述微孢子蟲在亞洲蜜蜂上的一個新種類，是東方蜜蜂微孢子蟲，被命名為Nosema ceranae。有人認為，N.ceranae主要侵染東方蜜蜂，然而有一種主張認為西方蜜蜂在實驗室條件下也可以被N.ceranae所侵染。2005年，有N.ceranae侵染臺灣地區的西方蜜蜂蜂群的報道。不久之后，N.ceranae侵染西方蜜蜂的事件相繼在歐洲、美國、中國以及世界范圍內被報道。在此文中將在行為學及生理學方面回顧有關N.apis的舊學說以及目前關于N.ceranae的新研究。在基礎生物學研究方面，診斷和控制N.ceranae，請登 錄 http://www.extension.org/pages/27064/Nosemaceranae-the-inside-story。

一、這兩種蜜蜂微孢子蟲的區別

這兩種蜜蜂微孢子蟲的不同之處在表1中列出，但是這里只討論形態和癥狀，其他更多的區別在后面的章節中有詳細描述。相比N.apis的孢子，N.ceranae的孢子稍微小些，不是很對稱而且兩個末端是尖的。N.ceranae孢子的橫斷面極絲的圈數比N.apis要少些。N.ceranae更能抵抗高溫，Fenoy等（2009）認為 60℃溫度持續一個月的時間，超過90%的N.ceranae孢子仍然可以存活。持續冷凍一個星期N.ceranae孢子將失去90%的侵染性，而N.apis孢子會保留100%的活力。N.apis侵染性的典型癥狀是在被N.ceranae侵染的蜜蜂中所缺少的：比如冬季在蜂箱入口內或附近排便，以及重癥感染的蜜蜂中腸呈乳白狀顏色。西班牙學者聲稱，N.ceranae的侵染率并不隨著季節呈典型的變化，而之前的學者指出N.apis的感染率在夏季降低而在春天則保持較高的侵染率。

表1 N.apis與N.ceranae的區別

二、N.ceranae比N.apis更有毒力

在西班牙廣泛被引用的研究表明，蜜蜂在實驗室內感染N.ceranae，接種7天和8天的時間后分別有94.1%和100%的死亡率。盡管在同樣的實驗下沒有N.apis作為對照，早期用N.apis所做的對比研究表明N.ceranae比N.apis的毒力要強得多。更多最近來自其他實驗室的研究并沒有發現這個區別。Forsgen和Fries（2010）對比蜜蜂感染其他種類的死亡率，并沒有發現二者的不同。MSU蜜蜂實驗室在感染這兩種微孢子蟲的實驗上，同樣沒有發現二者蜜蜂死亡率的不同。尚不明確是否西班牙微孢子蟲品種更具毒力，或者西班牙蜜蜂（Apis mellifera iberica）易受N.ceranae感染。

三、Nosema apis的影響

1.對工蜂和蜂王的影響 在20世紀90年代，T.R.Liu在加拿大進行了許多研究，大部分是N.apis在超微結構水平上對蜜蜂的影響。他的研究指出感染了N.apis的工蜂其來自中腸上皮組織、下咽腺和咽側腺（咽側體激素的來源）的細胞有超微結構上的變化。蜂王的卵母細胞感染了N.apis只需7天就已經退化（注：卵母細胞與雌性生殖細胞繁殖有關）。卵巢管鞘縮成皺紋狀。在卵質內卵黃粒分解成小的球體和顆粒狀的物質，卵母細胞更大面積的被溶解（被其自身的酶所破壞）。目前尚不明確是否受感染蜂王卵母細胞的退化是由于病變，缺少蛋白質營養，或者保幼激素分泌的增加而導致感染了微孢子蟲。

2.N.apis導致更早覓食及保幼激素的大量產生感染N.apis的工蜂比未受侵染的蜜蜂咽下腺小，并且更早退化。另外，受微孢子蟲感染的蜜蜂比未受侵染的蜜蜂在行為上更快速成熟。受感染的蜜蜂更加頻繁的守護，比未受侵染的蜜蜂更早有以下行為：定位飛翔、追隨跳舞及覓食。受感染的蜜蜂飼喂蜂王亦呈減少趨勢。一個理論模型預測，工蜂在這種狀態下對比其他工蜂將承受更多的風險寄生于此蜜蜂群體，Woyciechowski和Kozlowski（1998）證明在不利天氣條件下，受N.apis侵染工蜂比健康的工蜂有更多的覓食活動。

受N.apis感染的蜜蜂的變化十分類似那些人工應用保幼激素所導致的，較少的護理照料卻更多去搜尋食物。Huang等（2001）研究是否受感染的蜜蜂較早的覓食行為是由于早期TE1水平的上升。他們發現受感染的工蜂比預備覓食的工蜂更早的搜尋食物而且血淋巴保幼激素滴定度更高。有人提出，N.apis的侵染作用使早期JH滴定度增高而導致工蜂搜尋食物。更高的保幼激素滴定度可以實現幾個供選擇的機理：宿主咽側腺（CA）提高JH的分泌，減少JH的降解，或者由 微孢子蟲直接分泌JH。同樣的研究發現，口頭測驗JH生物合成的速率同JH的降解性一樣，受微孢子蟲侵染的蜜蜂比正常蜜蜂要高。工蜂隨著JH（CA）的來源而遷移，但是微孢子蟲血淋巴的保幼激素水平沒有明顯變化，而且這些蜜蜂早期并不尋找食物。這些結論表明，受微孢子蟲侵染的工蜂盡管JH降解性提高但由于其JH分泌的增多而有著較高的JH滴定度，從而比正常的蜜蜂在更早的日齡去搜尋食物。一些數據同樣表明Nosema apis不能夠直接產生JH。

受N.apis侵染的工蜂咽下腺較小而且較早的覓食行為很可能由于微孢子蟲侵染了中腸的上皮細胞，因此極大的削弱了宿主消化花粉的能力，此能力需要腺體的生長發育。受損的蛋白質新陳代謝可以推斷出中腸分解蛋白能力的較低，血淋巴內氨基酸數量較少，脂肪體中的蛋白質水平較低以及被感染的蜜蜂血淋巴蛋白質水平很低。營養的不足使卵黃原蛋白無法增加，它通常會抑制JH的產生。因此，在缺乏蛋白質營養的環境下JH在這些蜜蜂體內過早的增多。

目前尚不清楚在工蜂中是否N.ceranae引起了與N.apis同樣的變化：例如，較早的覓食行為和更多的JH產生。但是，基于這一事實，這兩種蜜蜂微孢子蟲都影響中腸上皮細胞，N.ceranae很可能引發同樣的工蜂早期覓食以及促進JH的分泌。此項研究正在Marla Spivak的實驗室內展開。

四、N.ceranae的影響

1.N.ceranae對學習和歸巢行為的影響 Kralj和Fuchs（2010）的研究認為，蜜蜂的歸巢行為主要受N.ceranae的影響，一些蜜蜂是受與N.apis的共同感染。他們發現，受感染的蜜蜂遠離蜂群6或10 m需花費更長的時間歸巢。當脫離蜂群30 m距離時，對比健康蜜蜂，受感染蜜蜂沒有歸巢的百分率要高些。研究者還發現，對比出發搜尋食物的蜜蜂，受感染蜜蜂在歸巢蜜蜂中占有更低的比率，這表示一些受感染的蜜蜂沒有成功的回到蜂巢中。尚不清楚為什么受感染的蜜蜂也沒有回到蜂巢中。由于研究應用的是已知日齡的蜜蜂，所以不是因為受感染的蜜蜂發育早熟的原因。受感染蜜蜂沒有適當的蛋白質營養，從而影響它們大腦的發育以及學習的能力。尚不清楚是否N.apis對蜜蜂的學習和歸巢行為造成了同樣的影響。我們試圖確定是否受N.apis侵染的蜜蜂更遠地偏離蜂群周圍，但是失敗了。

2.N.ceranae導致更多的能量消耗 Mayack和Naug（2010）對比了健康和受N.ceranae侵染蜜蜂的能量應激效應，從若干線索中發現受N.ceranae侵染的蜜蜂引發了能量應激。第一，受N.ceranae感染的蜜蜂對蔗糖溶液有更多反應（不像健康蜜蜂那樣挑剔）并在低糖濃度下伸出它們的喙。第二，受感染的蜜蜂在24小時內消耗30%的蔗糖溶液約87 μl，而健康的蜜蜂只消耗 60 μl。因此，這表明 N.ceranae使蜜蜂更“饑餓”并使它們喝掉更多糖漿。第三，24小時周期內，健康蜜蜂飼喂5，10，20或30 μl糖漿比受侵染的蜜蜂飼喂同樣數量的糖漿會存活的更好。但是，如果蜜蜂是自由采食，或者根本不飼喂，那么在它們的存活中這兩組沒有顯示出任何的不同。作者因此推斷N.ceranae在受感染蜂群中引發了能量應激，并推測這可能是縮短蜂群內受侵染蜜蜂的壽命的主要原因。

Martin-Hernández等（2011）對比這兩種蜜蜂微孢子蟲的能力消耗。研究發現，受N.ceranae侵染的蜜蜂死亡率和糖漿消耗最高，其次是受N.apis感染的蜜蜂，最低的是未受侵染的健康蜜蜂。此研究更進一步的證明N.ceranae比N.apis對蜜蜂產生的影響略有不同。

3.N.ceranae引起免疫抑制 Antunez等（2009）研究感染N.apis或N.ceranae后蜜蜂的免疫應答。測量被細菌感染之后在蜜蜂內所產生的幾個抗菌肽，abaecin、defensin和hymentoptaecin的基因表達。在三個基因中，在感染后或者4天或者7天，N.apis的侵染會引起基因表達的升高，對比健康蜜蜂，受N.ceranae侵染的蜜蜂在基因表達上沒有表現任何區別，亦或者顯著的減少（abaecin是7天）。這些數據表明，N.ceranae積極的抑制被感染蜜蜂的免疫應答，而N.apis則沒有。

Alaux等（2010）研究是否新煙堿類（吡蟲啉）和微孢子蟲（兩種類混合）對受感染蜜蜂有協同的相互作用。他們發現這兩因子的結合導致最高的死亡率和食物消耗。他們還發現，葡萄糖氧化酶活性，一種蜜蜂用來滅菌蜂群和幼蟲飼料的酶，與健康蜜蜂相比較，只有當兩因素的結合時它顯著的降低，只微孢子蟲或者吡蟲啉一種因素時，表明在兩種因素間有協同作用。因為聯合組顯示類似微孢子蟲孢子來計數的受微孢子蟲感染蜜蜂，似乎協同作用是由于N.ceranae的免疫抑制，使蜜蜂對殺蟲劑更敏感，而不是殺蟲劑降低了蜜蜂的抗性使微孢子蟲對其造成更大損害。

最近的一個研究，Vidau等（2011）發現在殺蟲劑和N.ceranae之間有類似的協同效應。在揭示氟蟲腈或噻蟲啉的亞致死量之后，受N.ceranae感染的蜜蜂比未受侵染的蜜蜂呈現更高的死亡率。N.ceranae與殺蟲劑對蜜蜂死亡率的協同效應并沒有與昆蟲解毒酶的減少有很大關聯。這是因為N.ceranae的侵染導致中腸和脂肪體內谷胱甘肽-S-轉移酶活性增加，而不是7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶活性。目前尚不清楚昆蟲解毒系統和免疫系統有怎樣緊密的聯系，因為一個是殺蟲劑誘導的，另一個是寄生蟲導致的。

4.N.ceranae對蜂王健康影響 Alaux等（2011）研究N.ceranae對8日齡蜂王產生的影響。他們發現N.ceranae不影響脂肪體含量，它是能量貯備的指示物，但是改變了卵黃原蛋白的效價，它是生育力和壽命的指示物，總抗氧化劑容量以及蜂王上顎腺信息素。奇怪的是與預測的方向相反，受微孢子蟲感染蜂王的這些影響變化都是增加的。原因可能是研究者只觀察了8日齡的蜂王，或許因為受N.apis侵染的工蜂加快生長發育。尚不明確是否年老的蜂王這些變化是保持不變或者與自身相反。

五、結論

關于N.apis的研究大多數在20世紀70年代至90年代，但是自從2007年人們對N.ceranae產生巨大興趣，尤其是國家在出現了蜂群崩潰失調病（CCD）之后。N.ceranae感染看來不能解釋在美國蜂群的消失，但是在西班牙它被推測是引發CCD的主要原因。兩種蜜蜂微孢子蟲對我們的蜜蜂造成危害的區別已經十分明確（表1）。盡管有著在N.ceranae病理學方面的諸多研究，但是生物學、流行病學方面還存在許多我們無法解答的問題。我們甚至不能確定有多少歸因于N.apis的舊學說可能實際上來自于N.ceranae，還有在美國N.ceranae存在了多長時間。到目前為止我們沒有在那段時間之前的單一樣本，我們只有N.apis和N.ceranae到來之后的。N.ceranae代替了N.apis的想法也是基于間接證據。然而持續的監測與否以及N.apis怎樣慢慢消失，這可能有幫于澄清答案。