生肌象皮膏對2型糖尿病大鼠潰瘍肉芽組織的胰島素樣生長因子-1及受體的影響*

李巧芬，常 柏

（1.天津中醫藥大學，天津 300193；2.天津醫科大學代謝病醫院，天津 300070）

糖尿病難治性潰瘍是導致糖尿病患者截肢致殘的主要原因。隨著全球性糖尿病患病人數的增加，糖尿病患者人均壽命的延長以及老齡化的趨勢，因糖尿病潰瘍而需要截肢的患者也在增加[1]。據統計1996年全球糖尿病患者為1.2億，預計到2025年，將達到2.5億以上，而大約15%的糖尿病患者將發生潰瘍或壞疽[2]。筆者應用生肌象皮膏在臨床上治療糖尿病潰瘍取得良好效果[3]，下面筆者對2型糖尿病大鼠潰瘍創面肉芽組織的胰島素樣生長因子-1及受體的含量的動態觀察，探討生肌象皮膏促進糖尿病大鼠難治性潰瘍愈合的機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 Wistar大鼠，雄性，清潔級，體質量（180±20）g，北京大學醫學部實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（京）2010-0034。

1.2 實驗試劑 氯仿、異丙醇、無水乙醇、（天津中醫藥大學中醫藥研究中心）；RNase-free離心管；200μL和 1000 μL Tips；Tris、DEPC（美國 Sigma 公司）；RT-PCR一步法試劑盒、引物合成、PCR小管、1.5 mL離心管（RNase free、寶生物工程有限公司）；TRIZOL Reagent（Invitrogen公司）。引物：IGF-ⅠRF：5-CGCTGTGTGGACCGGGATTT；IGF-ⅠRR:5-GCATGCACTCGCCATCGTG；IGFF：5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC；IGFR：5-GAAGATGGTGATGGGATTTC，由北京三博遠志生物技術有限公司合成。

1.3 實驗儀器 Universal 16R低溫高速離心機（Beckman公司）；BIPrisnxr7000PCR儀（PE公司）。

2 實驗方法及步驟

2.1 動物模型的制備 160只雄性Wistar大鼠，適應性喂養1周后，隨機抽取40只作為正常對照組，給予標準飼料喂養，其余120只為造模組給予高脂飼料喂養。8周后，空腹眼眶采血測空腹血糖和胰島素計算胰島素敏感指數（ISI=Ln[（FBG）（FINS）]-1），判斷動物出現胰島素抵抗后，尾靜脈注射1%鏈脲佐菌素（STZ）30 mg/kg，1周后檢測血糖，隨機血糖≥16.7 mmol/L，視為糖尿病造模成功，選取120只造模成功大鼠按照血糖和體質量分層隨機分為糖尿病對照組、凡士林組、生肌象皮膏組。4組動物均以水合氯醛腹腔麻醉后，背部剃毛，常規消毒，用打孔器于大鼠背部脊柱左側打孔（φ2 cm），潰瘍深及筋膜層，止血后以無菌紗布包扎，自由飲水與喂食。3 d后潰瘍創面有肉芽組織開始生長，潰瘍模型制備成功。

2.2 治療方法 4組大鼠單籠喂養，均每日換藥1次，祛除創面上硬痂，常規消毒，用生理鹽水沖洗創面。生肌象皮膏組外用生肌象皮膏紗條外敷，凡士林組用凡士林紗條外敷，空白組、糖尿病對照組均以生理鹽水紗條外敷。4組動物均自由飲水、進食，創面外用無菌紗布包扎，固定。

2.3 取材方法 分別于1、7、14、21 d每組處死動物10只，手術取新鮮肉芽組織共160份，于液氮保存備用。

2.4 實驗方法 利用反轉錄酶ExScript RTase將RNA反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板利用ES Taq HS進行Real Time PCR擴增反應

3 結果

見表1-2。

表1 各組時間段IGF-1值（±s，n=10）Tab.1 Value of IGF-1 of each day in every group（±s，n=10）

表1 各組時間段IGF-1值（±s，n=10）Tab.1 Value of IGF-1 of each day in every group（±s，n=10）

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；其余3組組間比較無差異。

組別 第1天 第7天 第14天 第21天生肌象皮膏組 1.18±0.371.56±0.48*2.09±0.545*0.14±0.04**凡士林組 1.12±0.232.51±0.36*3.34±1.600*0.13±0.02**糖尿病對照組 1.21±0.472.23±0.55*2.89±1.370*0.15±0.05**空白組 1.27±0.371.33±0.29*1.25±1.250*1.27±0.36**

表2 各組時間段IGF-1R值（±s，n=10）Tab.2 Value of IGF-1R of each day in every group（±s，n=10）

表2 各組時間段IGF-1R值（±s，n=10）Tab.2 Value of IGF-1R of each day in every group（±s，n=10）

注：與糖尿病對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與凡士林組比較，△P<0.05。

組別 第1天 第7天 第14天 第21天生肌象皮膏組 0.94±0.130.82±0.24* 0.77±0.12*△ 0.61±0.11*△凡士林組 0.89±0.180.61±0.220.49±0.180.32±0.08糖尿病對照組 0.97±0.300.56±0.150.40±0.110.33±0.05空白組 0.95±0.111.12±0.17**0.98±0.19**1.02±0.18**

4 討論

IGF-1與胰島素原高度同源，是有促細胞分化和增殖活性，幾乎所有組織和細胞都能分泌，其生物學功能還可通過自分泌和旁分泌來實現[4]。IGF-1通過激活磷脂酰肌醇信號通路，促進細胞增殖，誘導細胞分化，加速傷口愈合；同時能夠誘導堿性成纖維細胞生長因子、轉化生長因子-β等其他細胞因子表達，促進纖維粘連蛋白、聚葡萄糖胺和膠原等胞外基質的合成和分泌，影響創面修復后組織的改建。而IGF-1的大部分細胞效應是通過胰島素樣生長因子-1受體（IGF－1R）實現，因此，IGF-1R 的表達增強可以揭示IGF-1生物作用的增強[5]。

IGF-1與其受體特異性結合后引起的信號通路不僅參與調控細胞增殖和分化，而且還能夠抑制細胞趨向凋亡。IGF-1激活受體后，將胞外信號傳遞到細胞內，通過P38MAPK信號通路，促進P53蛋白及其下游分子P21降解，抑制細胞凋亡的發生。在潰瘍組織中IGF-1R表達較低，引起其抗凋亡的活性減弱，使得處于低氧和缺乏營養環境中的組織修復細胞大量凋亡，最終導致肉芽組織生長緩慢，數量減少，傷口愈合延遲。因此潰瘍組織內IGF-1R蛋白低表達可能是創面修復細胞趨向凋亡，傷口愈合遲緩形成潰瘍的原因之一[6-7]。

本實驗結果顯示，糖尿病各組動物的IGF-1在潰瘍早期呈高水平表達，而在晚期呈現低水平表達。可能由于胰島素樣生長因子與胰島素同源，糖尿病血中胰島素低水平狀態刺激周圍組織細胞分泌與胰島素同源的IGF-1。而糖尿病潰瘍后期IGF-1含量低水平表達，可能由于終末糖基化產物的大量堆積，嚴重的抑制組織、細胞的功能，使對胰島素樣生長因子的分泌減少。同時潰瘍后期細胞增殖的減慢和細胞凋亡的加快，細胞的數量、活性下降，周圍組織、細胞對胰島素樣生長因子的分泌量下降而導致IGF-1的含量降低。IGF-1的大部分細胞效應是通過IGF-1R實現，在本實驗中IGF-1R的蛋白含量在糖尿病大鼠創面肉芽組織中呈低水平表達，隨著潰瘍時間延長呈遞減趨勢，這可能由于高血糖引起糖基化產物蓄積導致細胞功能下降分泌IGF-1R下降，即使在糖尿病潰瘍早期IGF-1的高水平表達但不能充分與IGF-1R結合而不能發揮其促進細胞增殖、誘導細胞分化的生理功能。同時由于IGF-1R的低表達，引起抗凋亡的活性減弱，使組織修復細胞大量凋亡，導致肉芽組織生長緩慢。這與糖尿病創面愈合時間延長相一致。因此糖尿病創面修復遲緩可能由于胰島素樣生長因子受體的減少和晚期胰島素樣生長因子分泌的減少有關。

生肌象皮膏組IGF-1蛋白含量7 d分泌增加，第14天達到高峰與空白組比較差異無統計學意義，但有升高的趨勢。在21 d IGF-1的含量明顯低于空白組。IGF-1R的含量在各時間段均低于空白組，呈遞減趨勢。與糖尿病對照組比較有統計學意義。IGF-1有促進細胞增殖，誘導細胞分化，誘導堿性成纖維細胞生長因子、轉化生長因子-β等其他細胞因子表達，促進纖維粘連蛋白、聚葡萄糖胺和膠原等胞外基質的合成和分泌的作用。糖尿病各組IGF-1的含量高于空白組，但由于糖尿病導致的IGF-1R的下降，以致IGF-1的作用不能有效發揮。生肌象皮膏可以增加糖尿病創面肉芽組織中IGF-1R的含量而發揮IGF-1的功能而促進肉芽組織的生長。說明生肌象皮膏不能促進胰島素樣生長因子的分泌，卻能增加胰島素樣生長因子受體的含量而抑制細胞凋亡，而促進創面愈合。

[1]常 柏，甄 仲，陳 良，等.苦寒藥在肥胖2型糖尿病中的應用[J].天津中醫藥，2009，26（1）：35-36.

[2]Boulton A J.The diabetic foot:a global view [J].Diabetel Metab Res Rev,2000,16(1):78-80.

[3]常 柏，李巧芬，李曉軍.生肌象皮膏治療糖尿病難治性潰瘍64例[J].遼寧中醫雜志，2006，33（10）：1299-1300.

[4]Valentinis B,Baserga R.IGF I receptor signaling in transformation and differentiation[J].Molpathol，2001，54(3):133-137.

[5]Goidman R.Growth factors and chronic wound healing:past，present， and future[J].Adv Skin Wound Care，2004，17(1):24-35.

[6]Liu JP,Baker J,Perkins AS,et al.Mice carrying null mutations of the genes encoding insulin-like growth factor I(IGF-I)and type I IGF receptor(Igf1r)[J].Cell,1993,72:59-72.

[7]南開大學生物系.生肌象皮膏對開放損傷的作用[J].中華骨科雜志，1981，1（2）:124.