針刺對戊四唑致癇大鼠海馬神經元超微結構的影響*

昂文平 楊 帆 沈德凱 劉向國

（安徽中醫(yī)學院，安徽 合肥 230038）

癲癇是一組由不同病因所引起的腦神經元高度同步化異常放電所致。癲癇反復發(fā)作可導致腦神經元損傷，甚至死亡［1］。我們以往的研究表明針刺具有明顯的抗癲癇作用［2］。近來，臨床與實驗研究表明針灸對中風病具有很好的腦神經元保護作用［3］。為此，本實驗通過建立戊四唑誘發(fā)大鼠癲癇模型，給予針刺治療，通過HE染色和電鏡觀察癲癇大鼠海馬區(qū)病理改變及神經元超微結構變化，探討針刺對大鼠癲癇發(fā)作繼發(fā)腦神經元損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康SD大鼠72只（安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：皖醫(yī)實動準字第070211號），體質量約300 g。隨機分為3組：模型組、針刺組、正常組，每組24只，分別于癲癇發(fā)作后4 h與24 h兩個時間段取材，每個時間段取12只大鼠，其中6只用4%多聚甲醛內固定后取腦用于制作石蠟切片；另6只大鼠取活體海馬組織作電鏡觀察。

1.2 藥物與試劑 戊四唑，美國Sigma公司產品，用前以0.9%氯化鈉注射液配制成質量濃度為5 mg/mL的溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 模型制備［4］采用戊四唑50 mg/kg腹腔注射造成急性癲癇發(fā)作模型。正常組大鼠腹腔注射2 mL 0.9%氯化鈉注射液。

1.4 針刺方法 將大鼠放置在特制的高臺上，選用1寸28號毫針，針刺百會、大椎穴［5］，每5分鐘以左右捻轉手法行針1次，30 min后取針，結束治療。

1.5 標本采集與檢測 （1）大鼠經10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射深度麻醉，待翻正反射消失以后，按常規(guī)方法4%多聚甲醛左心灌注固定取腦。用刀片切去小腦并于視交叉前切去大腦，置入上述相同固定液中固定24 h，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，于海馬部位制成厚約5μm的石蠟切片，HE染色，400倍光學顯微鏡下觀察并攝片。（2）取活體大鼠海馬組織CA3區(qū)1 mm3大小，固定于2.5%戊二醛4～6 h后，將組織固定于1%鋨酸1 h，30%、50%乙醇脫水后放入70%醋酸鈾乙醇飽和液中12 h，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，表于銅網上，醋酸鈾、枸櫞酸鉛染液，透射電鏡觀察并攝片。

2 結 果

2.1 HE染色結果 正常大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)錐體細胞排列整齊，結構完整，光鏡下觀察，胞漿透明，細胞核呈圓形或橢圓形，核居中，大而圓，染色質分布均勻，核仁清晰，形態(tài)正常，核周間隙正常。模型組大鼠癲癇發(fā)作4 h后，海馬CA3區(qū)錐體細胞呈散在的細胞變性水腫，輪廓模糊、界限不清，細胞間距加大，錐體細胞數量減少，排列紊亂，出現較多受損的異常神經元，海馬結構失去完整，并見散在的深染、核固縮神經元，CA1區(qū)見少量神經元壞死、錐體細胞排列不整齊但程度較CA3區(qū)輕。癲癇發(fā)作24 h后，海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)錐體細胞層神經元稀疏，排列紊亂，神經元形態(tài)不完整，細胞腫脹或皺縮、輪廓模糊、界限不清，細胞間距加大。見圖1。

圖1 模型組4、24 h腦組織海馬切片（HE染色，×400）

針刺組在癲癇發(fā)作4 h大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)神經元較稠密，排列整齊，細胞有輕度水腫，細胞間距變化不明顯，受損的異常神經元均較少；癲癇發(fā)作24 h大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)神經元排列尚整齊，水腫、固縮不明顯，僅散在少量的變性壞死神經元。見圖2。

圖2 針刺組4、24 h腦組織海馬切片（HE染色，×400）

2.2 海馬神經元超微結構觀察 電鏡下可見正常組大鼠海馬神經元超微結構正常，核呈橢圓形，核膜完整清晰，染色質分布均勻，常染色質豐富，核仁較明顯，呈海綿狀，胞漿內粗面內質網，線粒體、高爾基體，核糖體均較發(fā)達，線粒體結構清晰完整。

模型組癲癇發(fā)作4 h后大鼠海馬神經元即出現損傷，超微結構觀察核膜不清晰，部分神經元表現為核固縮，線粒體膜不完整，斷裂；24 h后海馬神經元損傷加重，神經元核膜不清晰，核固縮，染色質邊集，線粒體膜斷裂，基質消失，出現明顯空泡化，伴內外膜的崩解，出現巨大線粒體，并有髓樣小體形成，部分膠質細胞空化、腫脹，細胞器稀疏，結構破壞，高爾基復合體囊泡和內質網腫脹，并觀察到凋亡細胞。見圖3。

圖3 模型組大鼠海馬CA3區(qū)神經元電鏡圖

針刺組大鼠海馬神經元損傷明顯減輕，其中4 h時間段神經元出現核膜較完整，異染色質稍增多，線粒體輕微腫脹；24 h時間段神經元核膜完整，粗面內質網較豐富、增寬不明顯，線粒體結構正常。見圖4。

圖4 針刺組大鼠海馬CA3區(qū)電鏡圖

3 討 論

研究顯示一次癲癇的急性發(fā)作就足以引起邊緣葉特定區(qū)域神經元的脫失［6-7］，由于癲癇的病程具有慢性和反復性的特點，因此上述病理損害會重復發(fā)生并不斷疊加。近年來對癲癇造成的腦損害研究成為重要的研究課題，臨床、病理和神經影像學都揭示了癲癇持續(xù)狀態(tài)可以造成嚴重的腦損害，尤其是海馬區(qū)的硬化，并直接導致癲癇反復發(fā)作［8］。本研究利用HE染色和電子顯微鏡技術對大鼠急性癲癇發(fā)作后4 h和24 h兩個時間段海馬的形態(tài)學研究表明：急性癲癇發(fā)作后4 h大鼠海馬神經元出現形態(tài)學改變，光鏡下見錐體細胞輪廓模糊、界限不清，細胞間距加大，細胞數量減少，排列紊亂，出現受損的異常神經元，海馬結構失去完整，并見散在的深染、核固縮神經元；電鏡下見核膜不清晰，部分神經元表現為核固縮，染色質，線粒體膜不完整，斷裂。24 h后光鏡下見錐體細胞變性、丟失加重，特別是門區(qū)、CA1和CA3區(qū)出現大量深染、固縮神經元，錐體細胞稀疏；電鏡下見核膜不清晰，核固縮，染色質邊集，線粒體膜斷裂，基質消失，出現明顯空泡化，伴內外膜的崩解，出現巨大線粒體，并有髓樣小體形成，部分膠質細胞空化、腫脹，細胞器稀疏，結構破壞，高爾基復合體囊泡和內質網腫脹。本研究顯示大鼠海馬結構在癲癇發(fā)作4 h即出現神經元變性脫失現象，隨時間推移神經元脫失明顯加重，此結果與他人研究相符［4，9］。針刺具有保護癲癇繼發(fā)腦損傷作用，實驗顯示針刺4 h，HE染色結果顯示針刺組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)神經元較稠密，排列整齊，細胞僅有輕度水腫，細胞間距變化不明顯，受損的異常神經元均較少；針刺治療24 h后大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)神經元排列仍較整齊，水腫、固縮不明顯，僅散在少量的變性壞死神經元。電鏡觀察也顯示：針刺組大鼠海馬神經元損傷明顯減輕，核膜完整光滑，核仁居中，線粒體結構正常，嵴完整，僅見部分線粒體輕微腫脹，部分高爾基體腫脹，形成囊泡。以上結果從神經元超微結構驗證針刺具有保護癲癇繼發(fā)腦神經元損傷作用。但由于癲癇繼發(fā)腦損傷的多通路性和針刺作用的多靶點性，針刺保護癲癇繼發(fā)神經元損傷的具體途徑尚不清楚，要想完全揭示針刺保護癲癇繼發(fā)腦損傷的機理尚需從多途徑、多靶點研究。

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