增強CpG免疫刺激作用途徑的研究進展

徐娜，張雪梅，王欽富

CpG 基序（CpG motifs）是指含有非甲基化的胞嘧啶（C）和鳥嘌呤（G）核苷酸核心的寡聚脫氧核苷酸（ODN）序列，又稱為免疫刺激序列，一般為6個寡聚核苷酸。1995年，Krieg等[1]研究發現非甲基化的CpG 二寡聚核苷酸是病原體 DNA 免疫刺激活性的結構基礎，自此，對 CpG 基序的各種研究得以展開，包括 CpG 基序免疫刺激機制、CpG 基序個數及結構對免疫刺激活性影響、CpG 寡聚脫氧核苷酸作為佐劑使用等。含有非甲基化 CpG 二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸作為一種免疫增強劑，在體內和體外均表現免疫刺激作用，可以引起先天性免疫反應。CpG 在體內能引起明顯且多樣化的免疫作用，包括樹突狀細胞和NK 細胞增殖、巨噬細胞和B 細胞的促炎癥細胞因子表達、Th1/Th2免疫應答的調控、血循環系統中的補體作用[2]。CpG 寡聚脫氧核苷酸序列作為佐劑時可明顯延長機體免疫記憶的時間，在較低濃度抗原刺激時 B 細胞就能反應，產生更高純度的抗體[3-4]。

作為疫苗佐劑，CpG 寡聚脫氧核苷酸在機體內的傳遞速率和降解速度是影響其效力的關鍵問題。而體型較大的動物需要較高的CpG 寡聚脫氧核苷酸注射量才能引起有效反應，一般要求 10 mg 以上，致使 CpG 在動物疫苗實際應用中成本較高。因此，研究增強 CpG 佐劑作用，減少CpG 應用劑量，會增加 CpG 寡聚脫氧核苷酸的應用與普及，在疾病防治中具有重要的實際意義。本文就近年有關提高 CpG 免疫刺激作用的新途徑進行綜述。

1 與傳統佐劑苦杏仁酶、鋁佐劑組合

誘導 Th1 型免疫反應的CpG 與誘導 Th2 型免疫反應的其他種類佐劑（如皂苷 A 或苦杏仁酶）的組合能導致Th1/Th2 免疫反應的相對平衡，這種作用在諸如鼠、兔、豬、牛等動物試驗中得到證明。CpG 與苦杏仁酶聯合制劑能明顯增加血清中和抗體。事實上，即使很少量的CpG（250 μg）與苦杏仁酶混合引起的作用也比單獨使用較大量 CpG（25 mg）強很多[5]。在綿羊體內 CpG是 2′5′A 合成酶的誘導劑。新生羊肺注入 CpG 與苦杏仁酶制劑，可引起 2′5′A合成酶分泌量達到最高，IFN-α、IFN-γ 分泌也有所增加，而且 CpG 用量減少 80%[6]，在豬體內的試驗表明 10% 苦杏仁酶和CpG 混合物引起的免疫反應與30% 苦杏仁酶和CpG 混合物引起的免疫反應效果相同[7]，在小鼠、羊的動物實驗中，兩種物質混合后IgG1/IgG2a 降低，IFN-γ分泌增加，小鼠脾臟 IL-4 分泌減少[6]，顯示出兩者聯合時對Th1/Th2 免疫反應平衡的影響，展現兩者聯合使用在疫苗中的潛力。苦杏仁酶增強 CpG 免疫刺激作用的具體機制還不明確，可能是因為苦杏仁酶引起注射位點組織損傷、發炎、細胞死亡、免疫細胞被募集，進而被 CpG 激活，而且苦杏仁酶作為乳劑可以幫助 CpG 緩慢釋放，增加反應持久性。

鋁具有免疫增強作用，是一種Th2 型佐劑，而 CpG是一種強大的Th1型佐劑，鋁和CpG 聯用時，有助于平衡Th1/Th2 型免疫應答。研究認為鋁佐劑增強 CpG 免疫刺激作用的原因可能是鋁激活一種NOD 樣受體 Nlrp3， Nlrp3可與TLR4 協同作用對抗細菌脂多糖[8]。

2 與聚磷腈組合

聚磷腈主鏈磷原子上的兩個側基可被具有不同特性的有機基團取代，從而得到性能不同的高分子聚合物，取代基的性質和數目會影響聚磷腈高分子的物化性質。PCPP是聚磷腈的一種，它是一類人工合成的可溶于水、可生物降解的聚合高分子物質，具有特殊結構和其他有機高分子難以比擬的特性，在生物醫學領域被用于疫苗佐劑和藥物載體（表1）。PCPP 與CpG 聯合使用有兩種途徑：一是可溶性的PCPP-CpG 制劑；另一種是用單價鹽溶液（NaCl）和二價陽離子（CaCl2）處理 PCPP，通過凝聚形成直徑為0.5～2.5 μm 含 CpG的PCPP 球狀微粒。

表1 聚磷腈的應用

PCPP 免疫時，Th2 反應占優勢；可溶性的PCPP-CpG誘導特異性抗體 IgG1 表達，IgG2a 反應顯著增強，抗體水平是單獨使用 CpG 或者 PCPP 所無法達到的，產生的IFN-γ 明顯增加[9]；當含 CpG的PCPP 球狀微粒免疫小鼠時，引發強烈的Th1 反應，而且 CpG 在淋巴細胞中停留的時間更長，但是受球狀微粒直徑大小的影響，微粒崩解時間 10～24 h 不等。

對 PCPP 佐劑作用機理的研究較少，機制尚不明確，對于PCPP 與CpG 協同作用的機制也不清楚。PCPP 作為一種高分子物質，在室溫避光條件下能保存數年，臨床應用之前還需要更多的實驗依據以保證使用的安全性。

3 與多種TLR組合聯用

病原體相關分子模式（PAMP）包括脂類、蛋白和核酸。不同種類 TLR 可以識別不同種類 PAMP，引起的下游反應也各不相同[10]。CpG 基序作為一種PAMP 可與哺乳動物的TLR9 相互識別，進而啟動依賴 MyD88的信號級聯反應[11]，提高 mRNA 轉錄水平，引發多種細胞的成熟、分化、增殖，多種細胞因子的表達增加。

聚肌胞苷酸 poly(I:C) 作為TLR3 配體，可被 TLR3識別，激活 MyD88 依賴和非依賴途徑[12]。Poly(I:C) 已在很多獸用疫苗中作為佐劑使用，它可以有效增強 Th1 型反應，在豬體內它能有效地誘導 IFN的產生，而且誘導單核細胞 MHCII和CD80/CD86的基因表達以及趨化因子、TLR-5、TLR-9、IL-12p35的產生[13]。Poly(I:C) 與CpG 聯合使用時，能協同上調細胞因子的表達，包括 IL6、IL1A、IFNA6、IFNB1、IL33、IL6、IL19、IL12A、IL10、CSF3、IL1F6等。有趣的是，編碼 IL33、IL19、IL12A和神經肽的基因在poly(I:C) 與CpG 兩種物質分別刺激時不會發生明顯變化，但是當 poly(I:C) 與CpG 兩種物質聯合使用時表達量會強烈增加。

R-848是人類 TLR7/8的人造配體。在HBsAg 疫苗動物試驗中，R-848和CpG 均有免疫刺激作用，CpG 激活體液免疫和細胞免疫的作用要優于R-848。然而，CpG 寡聚脫氧核苷酸和R-848 聯合應用并沒有表現協同免疫刺激作用，原因可能是兩者作為不同 TLR的配體，在激活下游反應時 CpG 寡聚脫氧核苷酸和R-848 重疊激活免疫細胞[14]。

4 佐劑共傳遞系統

CpG 寡核苷酸的臨床應用面臨很多問題，包括在機體內的穩定性、毒性，不利的藥代動力學特點，缺少靶細胞特異性等。因此，有必要構建有效保護 CpG 寡聚脫氧核苷酸并有助于抗原與CpG 寡聚脫氧核苷酸共傳遞的復合載體系統。

基于脂質體的傳遞系統可用于保護 CpG 寡核苷酸，調節 CpG 寡核苷酸分配，從而提高免疫細胞定位效率，促進胞內攝取。脂質體介導的傳遞能增加 CpG 寡核苷酸的免疫刺激效應，提高預防和治療效率。脂質體封裝 CpG寡核苷酸為其達到最佳免疫刺激和治療效果提供了可行的方法。含CpG 寡聚脫氧核苷酸的脂質體微粒作為佐劑與單純 CpG寡聚脫氧核苷酸佐劑相比，CpG 被遞呈細胞攝取的幾率提高近一倍，體液免疫（抗原特異性血清、IgG2a、IgA、CTL分泌量）和細胞免疫（脾細胞增殖、IFN-γ 分泌量、細胞毒性等）水平增加 10～100 倍[15]。含 CpG 寡聚脫氧核苷酸的脂質體微粒經由淋巴注射、皮膚注射、皮下注射、滴鼻 4種途徑免疫時，遞呈細胞攝取、IgG2a 滴度都有不同程度提高[16]，反映出含 CpG 寡聚脫氧核苷酸的脂質體微粒有較廣的適用范圍。

可電離的陽離子脂質體是一種納米粒子，在生理 pH時顯中性。由于脂質的疏水性，本身會形成雙層的膜脂質體小泡，表面電荷變化小，這是與傳統脂質體的不同之處。寡聚脫氧核苷酸是聚陰離子，其包裝就是依靠在酸性 pH 時兩種物質間的靜電作用，形成含有寡聚脫氧核苷酸的中性微粒[17]。還有一些可生物降解的陽離子微粒子共載體（如聚乳酸-羥基乙酸共聚物）可依附于帶負電寡聚脫氧核苷酸與帶正電微粒子表面之間的電荷作用，小鼠試驗數據表明[18]此共載體與單一 CpG 相比，lgG2a 活性可增強 50 倍，毒素中和活性滴度增加近 10 倍。

另外，殼聚糖載體具有天然免疫原性，可以增強 CpG寡聚脫氧核苷酸對機體內酶的穩定性。殼聚糖-CpG 復合物進入機體后，能被巨噬細胞表面的多糖類受體識別，激活巨噬細胞 RAW264.7；同時，也能促 NK 細胞和T 細胞活化，分泌多種細胞因子，表現出與CpG 寡聚脫氧核苷酸協同增效作用。殼聚糖-CpG 復合物與單純使用殼聚糖或 CpG 相比，前者抗體產生水平最高，持續時間長，CD4+ 細胞水平顯著增加[19]，增強了 CpG的免疫活性。因此，殼聚糖包裹CpG 寡聚脫氧核苷酸載體是一類很有應用前景的共載體系統。

總之，優良的疫苗佐劑不僅能引起較強的免疫刺激作用，還要物美價廉、易于推廣。通過其他物質增強 CpG 免疫刺激作用，為降低 CpG 使用量進而降低成本提供有效途徑，也為CpG 作為佐劑的研究提供新的思路和研究方向。隨著生化技術的日新月異、分子生物學和基因表達技術的飛速發展，CpG 作為佐劑的研究將會有新的發展和突破。

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