樹突狀細胞誘導的CIK 細胞對肺癌生長的抑制作用

陳詩萍，買世娟，余杏娟，柯妙拉，夏建川，高秋

隨著現代分子生物技術和腫瘤免疫學的發展，生物治療已成為繼手術、化療、放療后的第 4 種腫瘤治療模式。當前腫瘤生物治療技術包括分子靶點藥物、單克隆抗體、細胞因子、細胞免疫治療和基因治療。肺癌的生物治療依次經歷了細胞因子（如 IL-2）療法、腫瘤殺傷細胞[如自體細胞因子誘導殺傷細胞（cytokine-induced killer，CIK）]的過繼免疫治療、腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）療法和單克隆抗體療法，但效果均不理想。根據腫瘤細胞與免疫細胞之間的信號傳導及抗原呈遞過程方面的研究，無論何種生物治療方法，宿主體內的抗原加工與呈遞是誘發宿主免疫系統抗腫瘤免疫的核心。迄今為止，樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是所發現的功能最強的抗原呈遞細胞（APC）。有關研究已表明肺癌組織及外周血中 DC的數目與肺癌的預后呈成正相關，可是大多數肺癌組織中有 DC的數量減少或功能缺陷，因此考慮體外培養 DC 并用抗原刺激制備腫瘤疫苗，用于治療術后殘余病灶或微轉移的患者。但由于肺癌是實體瘤，抗原性較弱，DC 疫苗的療效還未肯定，所以有必要通過實驗觀察 DC 誘導的抗肺癌免疫作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 淋巴細胞分離液為天津美德太平洋科技有限公司產品；GT-T561 無血清培養基為日本 TaKaRa公司產品；GM-CSF、IL-4、IL-1、IL-2干粉為北京四環生物制藥有限公司產品；TNF-α、IFN-γ、CD3 購自廣州英韋創津生物科技有限公司；用 GT-T561 無血清培養基配成溶液。

1.1.2 儀器 JEM-2100F 型透射電鏡為日本電子株式會社產品；CYTOMICS FC500 型流式細胞儀為美國貝克曼公司產品。

1.1.3 實驗動物 SPF 級 BALB/C 裸小鼠50只，雌雄兼用，鼠齡 4～6周，體重 16～18 g，由中山大學醫學院實驗動物中心繁殖傳代（合格證：粵檢證字 2002A009）。飼養條件：恒溫，空氣層流過濾。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肺癌移植瘤模型建立 肺癌手術標本剪切成 2 mm×2 mm×2 mm的組織塊，接種裸鼠雙側背部皮下，模型建成后以等量移植瘤組織接種裸鼠，篩選有腫瘤生長的裸鼠以腫瘤體積為主要參數按照隨機的原則分組予以處理。計算公式為腫瘤體積=π/6(a+b)3，其中 a 為腫瘤長徑，b 為腫瘤短徑。

1.2.2 病理分析 取裸鼠肺癌移植瘤組織做病理切片，HE 染色觀察確定腫瘤類型，并與患者手術標本的病理切片比較。

1.2.3 DC 培養及負載 取用于建立裸鼠移植瘤的肺癌標本的同一患者的外周血，以淋巴細胞分離液常規分離，所得的單個核細胞用 GT-T561 無血清培養基重懸并調整細胞濃度為6×106個/ml，置37 ℃、5% CO2培養箱中靜止培養 1 h。貼壁的細胞成分中加入含有 IL-4（30 ng/ml）、GM-CSF（50 ng/ml）和慶大霉素（80 IU/ml）的GT-T561 無血清培養基培養，在培養的第 2、4、6 天補加含IL-4（30 ng/ml）和GM-CSF（50 ng/ml）的培養基。將同一患者手術切除的肺癌組織用反復凍融的方法制備腫瘤細胞裂解物，在培養第 8 天加到DC 細胞中，濃度為100 mg/L，4 h 后加入工作濃度為10 ng/ml的TNF-α，培養 24 h 以刺激 DC成熟。

1.2.4 CIK 細胞培養及誘導 上述未貼壁細胞中加入含慶大霉素（80 IU/ml）、IFN-γ（50000 IU）的GT-T561 無血清培養基中，第 2 天補加入細胞因子 IL-1、IL-2和CD3，使終濃度分別為50 ng/ml、50000 IU/ml和5μg/ml。培養第 5 天補加含 IL-2的GT-T561 無血清培養基，在培養第 9 天，以 DC 與CIK 細胞 1∶10的比例將腫瘤細胞裂解物負載的DC 加入 CIK 細胞中，繼續培養，所得的細胞為DC-CIK 細胞。

1.2.5 倒置顯微鏡及透射電鏡觀察 DC 細胞 每天應用倒置顯微鏡觀察 DC 及CIK 細胞生長情況。收集 DC，用 2% 多聚甲醛和22.5% 戊二醛混合液前固定，經 PBS 漂洗后，用 1% 鋨酸后固定，梯度乙醇脫水、滲透，LR White 樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察。

1.2.6 細胞表型分析 單個核細胞培養第 5 天及抗原刺激后收獲 DC，用 PBS 洗滌重懸后加入PE 或 FITC 標記的CD1a、HLA2DR、CD80、CD86、CD14 鼠抗人單抗，于培養第 5 天和第10 天即與DC 共孵育 24 h 后收獲 CIK 細胞，用PBS 洗滌重懸后加入 CY5-PE、PE 或 FITC 標記的CD3、CD4、CD8 及CD56 鼠抗人單克隆抗體，4 ℃ 孵育 30 min，用 PBS 洗滌 2 次，重新懸浮，流式細胞儀檢測。分析軟件為ELITE，樣本細胞數不少于5×105個。

1.2.7 荷瘤裸鼠處理及處理后觀察 按照隨機分組原則將裸鼠分為4組，分別為DC-CIK組、CIK組、DC組和NS組（生理鹽水對照組），每組9只。于裸鼠腫瘤同側腋窩皮下分別注射 DC-CIK細胞、未經誘導的CIK 細胞和DC。注射劑量為1×106個/只，注射液體總量為0.1ml/只。對照組注射等量生理鹽水。每星期觀察腫瘤生長情況2 次，直至處理后約 1個月，處死裸鼠稱取腫瘤重量，計算抑瘤率。

抑瘤率=（對照組平均瘤重－治療組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 動物模型的建立

成功建立肺癌移植瘤模型，肺癌手術標本和裸鼠移植瘤組織 HE 染色比較，兩者病理類型一致，但移植瘤的腫瘤惡性程度增加（圖 1）。

圖1 肺癌患者手術標本與裸鼠肺癌移植瘤的病理學比較（×200）（A：高分化乳頭狀肺癌標本；B：裸鼠移植瘤組織）Figure1 Pathological comparison between resected sample of lung cancer patient and implanted tumor in nude mice (×200)(A: Resected sample of lung cancer patient was diagnosed as well-differentiated palillary adenocarcinoma; B: Xenografted tumor in nude mice)

2.2 DC的形態及細胞表型結果

細胞培養 24 h 后可見有少數細胞懸浮；第3～4 天懸浮細胞較多，聚集成團，細胞體積增大，形態不規則，長條形多見，有突起；培養第 6～7 天時細胞體積增大明顯，呈多邊形，長的突起增多；于培養第 7 天及與腫瘤抗原共孵育 1 d 后透射電鏡觀察，可見 DC 有大量長短不一的突起由胞體伸出，細胞核呈腎形并偏于一側，常染色質增多，胞漿內富含線粒體和粗面內質網，較少溶酶體。與腫瘤抗原共孵育后，可觀察到 DC 細胞體積增大，突起增多增長，包繞并吞噬腫瘤細胞裂解物的現象（圖 2）。

圖2 透視電鏡觀察 DC的超微結構（A：DC 典型形態×2400；B：DC 捕獲抗原×6400）Figure2 Transmission electron microscopy of cultured DC[A: Typical appearance of DC (×2400); B: DC capturing antigen (×6400)]

培養第 5 天，HLA2DR、CD14 表達較高，CD80 表達量較低。抗原刺激后CD86 表達較高，CD80 及HLA2DR 表達增加，CD1a 也有表達，CD14 表達有所降低（表1）。說明加入腫瘤抗原刺激后細胞表型有變化，因此，經腫瘤細胞裂解物負載的DC是成熟型。

表1 DC 細胞表型結果Table1 Surface phenotype of DC cells

2.3 CIK 細胞的形態及細胞表型結果

培養第 3 天，CIK 細胞數目增多，體積也增大；第 7 天可見有細胞集落形成；當 DC 與CIK細胞共孵育 24 h 后所得的細胞即為DC-CIK 細胞，可見 CIK 細胞圍繞在DC的胞體及突起周圍。培養第 7 天電鏡觀察細胞核較大，核漿比例大，細胞核中異染色質較多，胞漿內細胞器較少。培養第 5 天及與腫瘤細胞裂解物負載的DC 共孵育后檢測 CD3、CD4、CD8 及CD56 抗原表達率，加入抗原刺激前后CD3、CD4 變化不明顯，而CD8 表達升高，CD56 表達降低（表 2）。

表2 CIK 細胞表型分析Table2 Surface phenotype of CIK cells

2.4 DC 誘導的CIK 細胞對肺癌移植瘤的生長抑制

肺癌移植瘤在裸鼠體內傳第 4 代時取等量移植瘤組織接種裸鼠，4組裸鼠腫瘤平均瘤重、瘤體積和腫瘤生長抑制率見表3。DC-CIK 細胞對腫瘤的生長有抑制作用，且較 CIK 細胞的抑制作用更強（P＜0.05）。

3 討論

本實驗采用外周血作為DC 來源，用 75 cm2培養瓶貼壁的培養方法，并且應用自體血漿作為DC 生長必需的營養來源。該法優點是取材方便，制備過程簡單，避免了應用異種血清 FBS 對 DC的干擾。本實驗應用患者自身手術切除標本作為腫瘤抗原來源，比較了抗原負載前后的表面抗原表達情況，刺激前 CD80 表達率較低，刺激后HLA2DR、CD80 顯著升高，表明該法制備的DC 已經成熟。成熟與未成熟 DC的功能不同，未成熟 DC 捕獲抗原的能力較強，但激發 T 細胞免疫反應能力較差，成熟的DC 具有較強的抗原呈遞功能，能將抗原呈遞給腫瘤抗原特異性 T 細胞，產生特異性的抗腫瘤免疫應答。本實驗制備的腫瘤抗原可以刺激DC 成熟并且使數量擴增，培養前后比較擴增率為4～5 倍。另外，本實驗從外周血一次分離所得的單個核細胞中，以貼壁的單核細胞作為DC的前體細胞，同時未貼壁的淋巴細胞用來培養 CIK 細胞，合理利用各種細胞成分，不致造成細胞浪費，減輕患者負擔。培養所得的CIK 細胞通過光鏡觀察發現細胞擴增明顯，采用流式細胞儀表型分析 CIK細胞與DC 共孵育前后抗原表達率的變化，CD3表達率升高、CD4 變化不明顯，而 CD8 表達則有所升高，CD16/56 表達率明顯下降，說明 DC-CIK主要是表型為CD3+、CD8+的T 細胞，與報道中 CIK 細胞主要是 NK和T 細胞的說法不同，可能與腫瘤相關抗原 (TAA)-DC能特異性誘導CD8+ 細胞有關。

表3 DC-CIK 對肺癌裸鼠移植瘤生長的抑制作用（ ）Table3 The antitumor effect of DC-CIK cells on xenografted tumor in nude mice ( )

表3 DC-CIK 對肺癌裸鼠移植瘤生長的抑制作用（ ）Table3 The antitumor effect of DC-CIK cells on xenografted tumor in nude mice ( )

實驗組Groups腫瘤平均體積（cm3）Average volume (cm3)腫瘤平均重量（g）Average weight (g)抑制率（%）Inhibition rate (%)P 值P value DC-CIK 0.3183±0.32 0.4700±0.38 70.3 0 CIK 0.9836±0.31 1.0522±0.25 33.5 0.053 DC 0.9871±0.38 1.3000±0.25 17.9 0.291 NS 1.7134±1.32 1.5833±0.99 – –

由于裸鼠體內 T 細胞免疫缺陷，選用裸鼠實驗對象消除了動物體內 T 細胞的干擾，另外實驗中以肺癌患者手術標本建立移植瘤模型，能夠更好地模擬患者體內情況，而且病理分析也發現移植瘤與手術標本病理類型一致，但是病理分級升高，這與患者術后微小殘余病灶的復發或者轉移的情況相似。所以本實驗實際上是以裸鼠為媒介模擬患者體內情況，觀察 DC-CIK的體內抗腫瘤作用，做到觀察的個體化。用肺癌手術切除標本建立移植瘤模型的過程中，發現傳代后接種成瘤率約為75%，所以本實驗不能預先觀察 DC 對肺癌移植瘤發生的預防作用，只能觀察其對移植瘤的生長抑制作用。

實驗過程中發現，在處理后的第 15 天左右，DC-CIK組中腫瘤開始較快地生長，這說明了DC-CIK 對體積較小的腫瘤抑制作用明顯，而隨著腫瘤體積增大，這種抑制作用減小。因而臨床上 DC應當用于治療手術后微小殘余病灶和微轉移病灶，而且應當縮短注射的間期。本實驗通過荷瘤裸鼠體內抗瘤實驗證實了 DC-CIK 細胞抗肺癌作用明顯高于CIK 細胞的作用，提示 DC-CIK 細胞治療是更為有效的抗肺癌生物治療方法，為DC 疫苗用于臨床治療提供了理論依據。

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