蛋白質相互作用研究的常用方法進展及比較

涂占晗 林 旭

福建醫科大學基礎醫學院，福建福州 350008

蛋白質相互作用研究的常用方法進展及比較

涂占晗 林 旭▲

福建醫科大學基礎醫學院，福建福州 350008

如今蛋白質間的相互作用已成為生命科學領域研究的重點，而各種蛋白質間相互作用的研究方法的飛速發展成為蛋白質研究的重點。本綜述中將著眼于酵母雙雜交方法新進發展與Sos系統、噬菌體展示、GST-pull down、免疫共沉淀、串聯親和純化等蛋白質相互作用研究方法做一比較分析。以便在未來的研究中，根據不同方法的優缺點選擇合適的研究技術。

酵母雙雜交；Sos系統；噬菌體展示；GST pull-down；免疫共沉淀；串聯親和純化

蛋白質作為生命活動的承載體已及功能的執行者，了解蛋白質的功能特性被視為理解生命活動的重要步驟。蛋白組學技術的不斷發展，使得發現新蛋白質以及研究其功能和機制成為如今生命科學界的熱門課題。由于極大多數蛋白質不能單獨行使其功能，而是通過與其他蛋白相結合形成復合體參與到細胞或機體的各種生理活動中。在對一種蛋白質的功能進行研究的過程中發現，直接對感興趣蛋白進行研究是非常困難的，通常利用蛋白與蛋白相互作用的特性，利用已知蛋白的功能對與其相互作用的未知蛋白的功能特性做出推斷及驗證[1]。到目前為止，已涌現出多種蛋白與蛋白相互作用的檢測技術，但各自的適用情況和優缺點各有不同。本文將著眼于酵母雙雜交方法新進發展與Sos系統、噬菌體展示、GST-pull down、免疫共沉淀、串聯親和純化等蛋白質相互作用研究方法做一比較分析進行綜述。

1 酵母雙雜交系統及Sos恢復系統

1989年，在研究真核基因轉錄調控的過程中，Fields和Song初步建立的酵母雙雜交系統[2]是近年來用于研究蛋白相互作用經典有效的方法。酵母雙雜交系統是依據GAL4轉錄激活因子的特性進行設計的。GAL4轉錄激活因子是一種由兩個彼此分離但功能必需的結構域組合而成的，即DNA結合結構域（DNA-BD）和轉錄激活結構域（AD），DNA-BD 能夠識別并結合位于GAL4反應元件的上游激活序列（UAS），但必需與AD結合后才能激活UAS下游的啟動子，從而表達出GAL4完整的轉錄因子活性，使啟動子下游的報告基因 （如ADE2、HIS3、LacZ、MEL1）得到轉錄表達[3]。 見圖 1。

圖1 酵母雙雜交檢測蛋白質相互作用機理

酵母雙雜交技術在蛋白質相互作用的研究方面具有敏感、高效、簡捷、真實、廣泛等諸多優點[4]，但它并非適用于所有蛋白質。因其原理決定，酵母雙雜交只能檢測定位于胞核內的蛋白，對發生在胞質和胞膜的相互作用或誘餌蛋白自身具有轉錄活性時，則不能將與其相互作用的蛋白質篩選出來[5]。

最近幾年，Sos恢復系統對經典的酵母雙雜交系統進行了彌補。Sos系統是應用一種突變菌株-cdc25H進行構建的。該菌株是一種在基因1328位置上有一個氨基酸殘基點突變，即CDC25基因。這種菌株不依賴轉錄激活機制但是對溫度敏感。在酵母菌株中的CDC25基因是人Sos（hSos）基因的同源基因，該基因可編碼一個能夠結合并激活Ras的脒基核苷酸交換因子，從而可啟動Ras信號轉導通路。該系統的特性是，在37℃的條件下生長的為CDC25基因不表達的cdc25突變體抑制菌株，但是25℃這個特定的溫度下卻允許突變菌株-cdc25H生長。經證實，人Sos（hSos）蛋白能夠補充cdc25菌株這種缺陷，并且具有激活酵母中Ras信號通路的功能，通過與其相互作用的蛋白可將表達出的hSos蛋白固定于細胞膜上，使得cdc25H酵母菌能夠在37℃生長。在該系統中，通過將誘餌蛋白基因構建到pSos載體上，而目的蛋白基因則構建到pMyr載體上可分別形成hSos和誘餌蛋白的融合蛋白，十四烷基化信號序列和目的蛋白的融合蛋白。由于十四烷基化信號序列的作用，目的蛋白可被固定于細胞膜上。繼而hSos蛋白能與誘餌蛋白作用，被固定在細胞膜上并激活Ras信號傳導通路，最終在37℃cdc25H菌株可得以生長。見圖2。

圖2 Sos系統原理示意圖

遺憾的是，該系統具有高背景假陽性等局限性，而應用GST-pull down和Co-IP實驗方法對初篩結果進行進一步篩查驗證即成研究的重要方法和關鍵性步驟。

2 噬菌體展示（PDT）

1985年 George P.Smith[6]在絲狀噬菌體（filamentous bacteriophage,fd）的外殼蛋白基因III中克隆入RI核酸內切酶基因片段獲得的噬菌體粒子可以在外殼蛋白中融合表達的酶分子。在之后的驗證中證實EcoR I內切酶抗體可以有效中和外殼蛋白表達有這種酶分子的噬菌體,此結果說明該酶分子的構象和活性與天然酶分子相同或極為相似。該實驗的成功標志著噬菌體展示技術的開始。該技術的基本原理是：噬菌體外殼蛋白與外源蛋白質或多肽的基因表達產物融合，并可展示于噬菌體表面，從而使得展示于噬菌體表面的外源多肽有較獨立的空間結構和生物活性,通過篩選表達有特異性多肽或蛋白的噬菌體而得到大量富集，然后進行DNA測序。該技術是將展示肽的表型與基因型通過絲狀噬菌體直接地聯系起來[7]，再利用其配體的特異性親和力，將有需要的蛋白質或多肽篩選出來[8]。Scott JK等[9]于1990年運用該技術構建了隨機多肽文庫，此文庫包含特定長度的隨機段肽，理論上涵蓋了某一長度短肽的所有氨基酸的排列組合序列。因依靠特定的氨基酸或特異性的肽段，可使蛋白質間相互識別和作用。據該原理所述，用受體蛋白對隨機肽庫進行篩查，以獲得與之結合的短肽序列，由篩得的短肽序列便可得到與目的蛋白相互作用所依靠的氨基酸殘基序列[10]，即可進一步研究蛋白間的分子識別和結合等等。

這一研究技術也證明了無需了解蛋白的詳盡結構也能夠對其相互作用進行檢測。迄今為止，已構建成功的噬菌體表達載體f1、M13、T4等，成為蛋白質組學研究中的重要工具。2004年，通過噬菌體展示技術的運用，Jespers L等[11]運用熱變性的原理發展了一種方法選擇和鑒定抗凝集蛋白，從而防止或促進蛋白的凝集反應，且在診斷凝集蛋白引起的疾病方面有重大意義。

3 GST-pull-down

Smith DB和其研究團隊[12]于1988年利用谷胱甘肽-s-轉移酶 （GST）融合標簽純化出GST融合蛋白，GST-pulldown開始成為一種熱門研究方法。GST-pull-down這一研究方法是將誘餌蛋白的編碼基因與GST標簽整合后表達，表達的融合蛋白經純化后與有目的蛋白質的溶液孵育。經一定時間的孵育后即會形成GST-融合蛋白-目的蛋白復合物，并用谷胱甘肽-Sepharose將其沉淀下來。最后通過聚丙烯酞胺凝膠電泳（SDS—PAGE）方法鑒定獵物蛋白。GST-pull down主要有兩方面用途：（1）鑒定能與已知融合蛋白質相互作用的未知蛋白質；（2）驗證兩已知蛋白質之間是否存在相互作用。

該方法特異性較強，也較簡便，能減少一定的假陽性率，也不需要使用同位素等危險物質，在研究蛋白質相互作用中應用廣泛。但該方法不適用于大規模篩查相互作用的蛋白，除此之外，活性融合蛋白的量及避免內源性誘餌蛋白干擾是該方法成功的關鍵。

4 免疫共沉淀（Co-IP）

免疫共沉淀是一種研究蛋白質之間相互作用的特異性強的研究方法。該技術運用特異性抗體與蛋白特異性結合的原理，通常是蛋白或其復合物與帶有標簽蛋白的特異性抗體的融合蛋白相互結合，形成蛋白復合體。用試劑將蛋白質復合體進行溶解，再利用通過親和色譜柱對標簽蛋白具有特異吸附作用的特性將蛋白復合體分離純化出來，最后運用SDSPAGE、雙向電泳或質譜等技術對分離所獲的蛋白進行鑒定。

此方法同樣不適用于相互作用蛋白的大規模篩查，但其優勢在于能用于確定在生理條件下在細胞或組織內是否存在與目的蛋白能夠結合并作用的蛋白質，亦可運用該方法驗證蛋白間的相互作用。見圖3。

圖3 免疫共沉淀原理圖

5 串聯親和純化（TAP）

Rigaut G等[13-14]在1999年一同提出了一套稱為串聯親和純化（TAP）的研究方法，用于分離復合蛋白，該技術兼備了免疫共沉淀和標準親和純化的優點，成為鑒定和分離蛋白質復合體新途徑[15]。該研究方法首先將TAP標簽整合于該蛋白質的一端，標簽由一個鈣調蛋白結合多肽（CBP）與蛋白標簽組成，并將TEV蛋白酶切位點插入二者之間，之后用帶有TAP標簽的基因置換內源的蛋白基因并表達，且可與特定蛋白進行識別和結合裂解細胞，提取細胞總蛋白，并將所獲總蛋白加入IgG親和柱。親和柱上的IgG可與TAP標簽的ProA端特異性結合，之后用洗脫液洗脫大多數非特異性結合蛋白，依次在洗脫液（含TEV蛋白酶）洗脫和鈣離子的協助下，獲得高純度的目的蛋白復合體（見圖4）。經上述步驟所得的蛋白質復合體再進行SDS-PAGE電泳分離及質譜分析，進而可發現其中的新組分或新蛋白復合物。

圖4 重組標簽融合蛋白的結構示意圖

此種研究方法不僅能保持復合物結構的完整性，并且能夠得到純度較高的特異性。因該技術的靈敏性、可靠性和特異性都優于傳統的酵母雙雜交技術，尤其適用于研究蛋白質在生理條件下的相互作用。但是，該技術在對高等真核細胞進行研究時卻因原位蛋白標記難在真核細胞內進行，且易受內源蛋白的干擾等因素而具局限性。Foler D及其科研團隊[16]將RNAi技術與TAP方法結合（iTAP技術），內源基因可通過此技術發生沉默，減少內源性基因的競爭性干擾作用。

6 對未來蛋白與蛋白相互作用研究的展望

機體內蛋白之間的結合和相互作用是機體生理活動的基礎。通過不同的蛋白質研究技術可了解和闡明蛋白相互作用及新蛋白的發現和作用機制等重要問題。蛋白組學研究的興盛標志著后基因組時代的到來，蛋白功能的研究成為重中之重。以近期國內外該領域的趨勢,現階段蛋白質研究的熱點已鎖定于研究蛋白質之間的相互作用關系的揭示及其網絡圖的建立。多樣化的蛋白質相互作用的研究方法，給科研工作者提供了多種多樣的研究途徑，但不同的研究方法具有各自的適用范圍及優劣性，研究者需要根據自己的研究對象及課題設計，選擇合適的一種或幾種研究方法。同時，隨著科研條件和材料科學地不斷突破，許多新的研究技術和方法在不斷推陳出新，不斷改進，這對蛋白質的功能研究及解釋蛋白質在生命活動中的角色和機制，具有重大意義。蛋白組學的發展必將推動生命科學大步向前。

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The advance and comparison in common research methods for protein-protein interactions

TU Zhanhan LIN Xu
Preclinical Medicine of Fujian Medical University,Fuzhou 350008,China

Protein-protein interaction has become a significant subject in life science research.With the rapid development,there are various research approaches have created for studies of protein-protein interaction.This review will make comparisons between the yeast two-hybrid,Sos,co-immunoprecipitation,GST pull-down,phage display,tandem affinity purification which are all the methods for this research.After that,it will analyze their own application characteristics.Finally,this review will discuss how to choose a suitable approach in different protein-protein interaction research based on different aims and requirements.

Yeast two-hybrid;Sos；Phage display;GST pull-down;Co-immunoprecipitation;Tandem affinity purification

R34

A

1674-4721（2012）05（b）-0018-03

▲通訊作者

2012-02-29本文編輯：陳 ?。?/p>