番茄紅素對TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

顏林淋 劉廠輝

番茄紅素對TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

顏林淋 劉廠輝

目的 探討番茄紅素對TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷的保護(hù)作用。方法 體外培養(yǎng)HUVEC，用0、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的TNF-α與HUVEC共同孵育30min，乳酸脫氫酶實(shí)驗(yàn)檢測TNF-α處理對HUVEC的毒性作用。選取TNF-α干預(yù)對HUVEC細(xì)胞造成損傷的最佳濃度，并在處理前加入不同濃度的番茄紅素作用1h，WST-1實(shí)驗(yàn)檢測HUVEC的增殖情況。結(jié)果 10 ng/mL TNF-α與細(xì)胞共同孵育30min后，對細(xì)胞造成的毒性作用最明顯。當(dāng)HUVEC預(yù)先與5μmol/L 番茄紅素孵育后，能顯著降低TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。結(jié)論 番茄紅素能顯著降低TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，這可能是番茄紅素防治一些炎癥相關(guān)性疾病的機(jī)制之一。

番茄紅素；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；TNF-α

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)引起的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是威脅人類健康最常見的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率居各類心血管疾病首位[1]。研究證明AS斑塊形成與血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能損傷有著密切關(guān)系，而內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動脈粥樣硬化形成早期病變的始動環(huán)節(jié)[2]。因此探討并研究具有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的生物活性藥物，對防治冠狀動脈粥樣硬化性心臟病具有重要的意義。本研究旨在觀察番茄紅素對TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的影響，以進(jìn)一步以了解其細(xì)胞保護(hù)作用。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 HUVEC細(xì)胞株購自武漢大學(xué)中國細(xì)胞典藏中心；RPMI 1640培養(yǎng)基為Invitrogen產(chǎn)品。新生牛血清購自杭州四季青公司。番茄紅素試劑購自美國Sigma公司；DMSO購自上海生物工程有限公司。WST-1細(xì)胞毒性檢測試劑盒為江蘇碧云天公司產(chǎn)品，CytoTox 96非放射性細(xì)胞毒性分析試劑盒購自Promega。細(xì)胞培板為Corning產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HUVEC用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶后消化傳代，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即傾去胰蛋白酶，加適量含血清的培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液，用含血清的1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度后轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)，使其12～24h內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)到約90%以上，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖褂谩?/p>

1.3 乳酸脫氫酶檢測 用消化液消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，100μL/孔。待細(xì)胞達(dá)到80%融合時，加入不同濃度的TNF-α（0ng/mL、5ng/ mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL和80 ng/mL）孵育30min。采用CytoTox 96非放射性細(xì)胞毒性分析試劑盒檢測LDH的釋放情況，檢測波長為450nm。

1.4 WST-1實(shí)驗(yàn) 選取上述TNF-α干預(yù)HUVEC細(xì)胞造成損傷的最佳濃度，并在處理前先加入不同濃度的番茄紅素作用1h。實(shí)驗(yàn)終止前每孔加入WST-1100μL繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄培養(yǎng)液，酶標(biāo)儀上測定570nm波長下的吸光度，計算細(xì)胞增殖抑制率。其計算公式為：細(xì)胞生長抑制率（%）=（1-試驗(yàn)組吸光度/對照組吸光度）×100%。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TNF-α對HUVEC細(xì)胞毒性的影響 用0ng/L、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL和40ng/mL TNF-α作用于HUVEC后，LDH漏出實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著TNF-α濃度的增加，LDH釋放逐漸增多。見表1所示。

表1 不同濃度TNF-α對HUVEC細(xì)胞的毒性作用

表2 不同濃度番茄紅素對損傷的HUVEC保護(hù)作用

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是襯貼于血管內(nèi)的單層扁平細(xì)胞，除了構(gòu)成血管的重要屏障外，它還具有重要的生理功能，包括產(chǎn)生和釋放各種血管活性物質(zhì)，從而在維持血管的完整性以及調(diào)節(jié)血管張力等方面起著重要作用。同時，血管內(nèi)皮細(xì)胞也是各種內(nèi)外源性損傷因素作用的部位，也是動脈粥樣硬化發(fā)生的始動原因之一[3]。本研究選擇的HUVEC是研究內(nèi)皮功能的常用細(xì)胞。而TNF-α作為一種炎性細(xì)胞因子，不但能引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，而且是啟動炎癥反應(yīng)導(dǎo)致AS發(fā)生發(fā)展的一個重要因素。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著TNF-α濃度的增高，HUVEC產(chǎn)生的LDH逐漸增高，表明TNF-α對內(nèi)皮細(xì)胞具有直接毒性作用，因此本研究用TNF-α來建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。

番茄紅素是一種類胡蘿卜素，人血漿番茄紅素濃度為0.2～5μmol/L。番茄紅素作為一種天然色素廣泛存在于番茄、胡蘿卜、西瓜和番石榴等蔬菜和瓜果中?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，番茄紅素具有多種生理功能，包括抗氧化、清除自由基、預(yù)防腫瘤和心血管疾病以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等作用[4]。除了上述功能外，也有研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素具有一定的抗炎作用[5]，但是否能對內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用尚不清楚。本研究擬通過采用TNF-α建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，結(jié)果表明，隨著番茄紅素濃度的增加，TNF-α所誘導(dǎo)的細(xì)胞抑制功能逐漸減弱，當(dāng)番茄紅素濃度達(dá)10μmol/L時，TNF-α的抑制作用僅為4.2%，這表明番茄紅素能在一定程度上起到預(yù)防內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用。

目前臨床上治療AS主要采用他汀類藥物[6]。本研究提出采用番茄紅素治療TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，是一種有效的補(bǔ)充治療方案。由于番茄紅素來源于日常食用植物，因此具有副作用小，使用安全等優(yōu)點(diǎn)，具有廣大的應(yīng)用前景。這有望為臨床治療提供更多的選擇。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2012.26.019

421001 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科 （顏林淋 劉廠輝） 432000 湘南學(xué)院附屬醫(yī)院（顏林淋）