干法糖基化改性提高大豆分離蛋白的乳化性

趙海賢，于國萍

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白含人體所必需的8種氨基酸，且比例比較合理，現已成為重要的蛋白資源和優良的食品原料[1]。在大豆分離蛋白的制備和加工過程中,應用不同的處理方法,都會引起蛋白質理化性質發生變化,經適當改性可產生所期望功能性質,提高其作為功能性成分在食品工業中應用。

目前蛋白質的改性有物理、化學和酶等方法。糖基化改性是化學改性的一種，該反應基于美拉德（Maillard）反應，不需要任何化學試劑作為催化劑，僅加熱就可使該反應自發地進行，經接枝改性的蛋白質功能性有很大的提高，是目前蛋白改性眾多方法中較為理想的方法[2]。

乳化性是蛋白質可應用性的一個很重要的指標，它與蛋白質的溶解性、凝膠性和起泡性等有著密切的關系，直接關系到蛋白質在食品工業中的應用，因而通過改性提高蛋白的乳化性是及其必要的。已有文獻報道，糖基化改性是提高蛋白乳化性的一種有效途徑。Nakamura等合成的溶菌酶-葡聚糖的共價復合物具有很好的乳化特性，并且提高了溶菌酶的抗菌范圍[3]，Moreno將酪蛋白與乳糖在40℃條件下反應，乳化性得到明顯改善[4]。本論文旨在通過糖基化改性，使大豆分離蛋白與葡聚糖發生干法接枝反應，改善大豆分離蛋白的乳化性能，從而實現大豆分離蛋白功能特性的有效改善和充分利用，解決植物蛋白開發功能性食品配料的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白：哈爾濱高科大豆食品公司；非轉基因九三大豆油：市售；葡聚糖2萬（右旋糖酐）：Sigma公司。

FD-1PF冷凍干燥機：上海田楓實業有限公司；YQ-3型電動勻漿機：江蘇江陰科研器械廠；722-2000型分光光度計：山東高密彩虹分析儀器有限公司；BIO-RAD Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀：美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 糖基化蛋白的制備

將不同質量比的大豆分離蛋白與葡聚糖的混合物溶于pH 7.8,0.067 mol/L的磷酸鹽緩沖液中[蛋白濃度5%（g/mL）]，磁力攪拌使其充分溶解，然后將混合液冷凍干燥，將冷凍干燥的固體樣品磨碎達到2種原料充分混合的效果。將一定量的粉末裝入稱量瓶中，放在裝有KBr飽和溶液的密閉容器中（相對濕度為79%），在60℃下進行Maillard反應制備糖基化蛋白[5]，分別在不同的時間取樣待測。

1.2.2 乳化活性和乳化穩定性的測定

采用濁度法[6]，具體操作如下：

將糖基化蛋白樣品溶于pH 7.0的0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液中，使其濃度為0.1%（g/mL），取30 mL的待測糖基化蛋白樣品溶液，加入10 mL的大豆油，在10000 r/min轉速下分散1 min，分別于0和10 min從溶液底部吸取100μL乳濁液，加到10 mL 0.1%SDS溶液中，于500 nm處測定吸光值，以0.1%SDS溶液為空白。用零時刻的吸光值A0表示乳化活性（EA），乳化穩定性用ES＝A0×10/（A0－A10）表示，其中A10－將乳狀液放置10 min后測得的乳化活性值。

1.2.3 各種因素對糖基化蛋白乳化性的影響

1.2.3.1 干熱反應時間對糖基化蛋白乳化性的影響

在糖-蛋白質量比為 2∶1，pH=7.8，T=60 ℃，相對濕度79%的條件下，改變反應時間分別為 6、12、18、24、30 h，制備糖基化蛋白，按1.2.2方法測定糖基化蛋白的乳化性。

1.2.3.2 干熱反應溫度對糖基化蛋白乳化性的影響

在糖-蛋白質量比為 2∶1，pH=7.8，t=18 h，相對濕度79%的條件下，改變反應溫度分別為40、50、60、70、80℃，制備糖基化蛋白，按1.2.2方法測定糖基化蛋白的乳化性。

1.2.3.3 糖-蛋白質量比對糖基化蛋白乳化性的影響

在溫度60℃，反應時間18 h，pH 7.8，大豆分離蛋白用量不變的條件下，改變糖-蛋白質量比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，制備糖基化蛋白，按 1.2.2 方法測定糖基化蛋白的乳化性。

1.2.3.4 乳化體系的pH對糖基化蛋白乳化性的影響

在糖-蛋白質量比為 2∶1，t=18 h，T=60 ℃，pH 7.8，相對濕度79%的條件下制備糖基化蛋白，改變乳化體系的 pH 分別為 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12[7]，按 1.2.2方法測定糖基化蛋白的乳化性。

1.2.4 糖基化改性提高大豆分離蛋白乳化性條件的優化

影響Maillard反應的因素很多，出于實驗的綜合考慮，確定相對濕度為79%，乳化液中蛋白濃度為0.1%，分別對糖蛋白制備的反應時間，反應溫度，糖-蛋白質量比，乳化液的pH進行四因素三水平L9（34）正交設計試驗。

1.2.5 凝膠電泳分析

糖基化蛋白分子量的分布用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）進行分析。SDS-PAGE凝膠配方為：10%分離膠和5%濃縮膠（含0.1%SDS）。濃縮膠電壓控制在80 V，分離膠電流控制在120 V[8]。

1.2.6 數據統計及分析

文中數據為3次測定值的平均值±標準偏差。采用SPSS13.0軟件的One Way ANOVA對數據進行顯著性分析（p＜0.05）。

2 結果與討論

2.1 干熱反應時間對糖基化蛋白乳化性的影響

干熱反應時間對糖基化蛋白乳化性的影響如圖1所示。

從圖1中可以看出，不同時間的大豆分離蛋白-葡聚糖干熱反應復合物的乳化能力均有很大程度提高。統計結果表明，當反應時間小于18 h時，時間對乳化活性（EA）的影響顯著（P<0.05），當時間達到18 h后，乳化活性增長趨勢漸緩，而乳化穩定性隨著反應時間的延長呈現先增加后降低的趨勢，在反應時間為18 h時，乳化穩定性（ES）達到最大值。

蛋白質與多糖的接枝反應中，反應開始時，隨著加熱時間的延長，蛋白質結構部分展開，多糖與蛋白質受熱逐步結合，促進SPI球狀分子伸展，疏水基團暴露，從而大大提高了溶液的乳化活性。但是加熱時間過長，一方面使蛋白質分子的一些賴氨酸被破壞，另一方面造成蛋白質結構的伸展，增加蛋白質的相互作用，導致凝聚和沉淀，不利于蛋白質與多糖發生相互作用[9]。而且隨著時間的進行，混合樣品的顏色由淺變深（即發生Maillard褐變），不利于產品的應用。因此時間選擇在18 h，乳化活性（EA）和乳化穩定性（ES）都較高，分別是其相同條件下對照樣（反應時間為0 h）的1.63倍和1.81倍，且褐變程度相對較小。

2.2 干熱反應溫度對糖基化蛋白乳化性的影響

干熱反應溫度對糖基化蛋白乳化性的影響如圖2所示。

統計結果表明，溫度對復合物乳化性的影響顯著（P<0.05）。大豆分離蛋白的乳化活性和乳化穩定性隨著反應溫度的升高呈現先上升后下降的趨勢。當溫度小于60℃時，乳化活性隨著溫度的升高而上升。當溫度大于60℃時，乳化活性隨著溫度的升高而下降。而對于乳化穩定性來說，溫度為70℃時最好，但隨著溫度的升高，副反應（Maillard褐變）程度加深，所以選擇60℃為反應溫度。此時乳化活性和乳化穩定性均較高，分別是其相同條件下對照樣（反應時間為0 h）的1.57倍和1.32倍。

2.3 糖-蛋白質量比對糖基化蛋白乳化性的影響

糖-蛋白質量比對糖基化蛋白乳化性的影響如圖3所示。統計結果表明，底物配比對乳化活性和乳化穩定性的影響顯著（P<0.05）。乳化活性和乳化穩定性都是隨著底物配比的升高呈現先上升后下降的趨勢，在葡聚糖與蛋白之比為2∶1時，二者均取得最大值。此時乳化活性和乳化穩定性是相同條件下蛋白對照樣（反應時間為0 h）的1.52倍和1.70倍。

蛋白和多糖的分子間共價鍵合是在一定的基團間進行的。為了得到具有一定乳化能力的復合物,要求反應物的配比適當,以期實現最佳比例的鍵合。理想的產物應該是蛋白的一部分疏水基團與多糖發生共價鍵合增加復合物的親水性，但又能保留有足夠的疏水基團來維持產物的表面活性[10]。適當的底物配比不僅可以提高反應的速度和最終的反應程度，而且還可以減少副反應（如焦糖化）的發生[11]。

2.4 乳化液的pH對糖基化蛋白乳化性的影響

不同pH下糖基化改性大豆分離蛋白和大豆分離蛋白的乳化性的變化如圖4，圖5所示。

圖4顯示大豆分離蛋白的乳化活性受pH影響較大，相同pH下糖基化改性大豆分離蛋白的乳化活性明顯高于未改性的大豆分離蛋白。在pH 3～5之間，由于等電點的出現，使其溶解性下降，因而導致了其乳化活性的下降，隨后乳化活性呈緩慢上升的趨勢，直到pH達到8時，乳化活性達到最大，隨后隨著pH的增大，乳化活性成下降趨勢；乳化穩定性的變化趨勢（見圖5）與乳化活性相似，只是糖基化產物的乳化穩定性的最高的pH為7.0.這可能是因為在強堿條件下

SPI降解成小分子，減少了相互作用，體系對油的包容作用減弱，從而乳化性能下降[12]。

2.5 糖基化改性提高糖基化蛋白乳化性條件的優化正交試驗設計及結果分析見表1，表2，表3。

表1 L9（34）正交試驗結果Table 1 Result of L9(34)orthogonal experiment

表2 正交試驗結果分析（乳化活性）Table 2 Analysis of L9(34)orthogonal experiment(emulsifying activity)

表3 正交試驗結果分析（乳化穩定性）Table 3 Analysis of L9(34)orthogonal experiment(emulsifying stability)

正交試驗結果分析見表2和表3，由表2可以得出干法糖基化改性提高大豆分離蛋白乳化活性的最佳工藝條件為A3B3C2D3。即：反應溫度70℃，反應時間24 h，糖-蛋白（2∶1），pH 8。其影響因素的重要性依次為：反應溫度>反應時間>pH>底物配比。由表3可以得出干法糖基化改性提高大豆分離蛋白乳化穩定性的最佳工藝條件為 C3B3A3D3，即：糖-蛋白（3∶1），反應時間24 h，反應溫度70℃，pH 8。其影響因素的重要性依次為：底物配比>反應時間>反應溫度>pH。由此可知本試驗檢測的幾個條件對糖基化蛋白乳化活性和乳化穩定性的影響是不完全相同的，在反應溫度70℃，反應時間24 h，pH 8的條件下，糖-蛋白比為 2∶1時，糖基化蛋白的乳化活性最高。而糖-蛋白比為3∶1時，乳化穩定最高，在各自最佳條件進行驗證實驗，制得糖基化蛋白的乳化活性為0.83，乳化穩定性為59.28，分別是其相同條件下對照樣的1.66倍和2.06倍。

2.6 SDS-PAGE分析

為了證實大豆分離蛋白-葡聚糖之間發生接枝反應，進行了SDS-PAGE分析。電泳結果如圖6示。

圖6 SPI及SPI-D糖基化蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE analysis of SPI and SPI-D conjugates

圖譜顯示，改性后，糖基化蛋白的電泳譜帶相對于SPI的譜帶來說，分子質量大于31000的蛋白條帶基本消失，而在分離膠頂端出現了明顯的高分子量的蛋白條帶，說明SPI中較大分子質量的亞基與葡聚糖作用，形成分子量更大的糖基化蛋白。

3 結論

1）以乳化活性為指標，確定大豆分離蛋白-葡聚糖干法改性最佳工藝條件為：反應溫度70℃，反應時間24 h，糖-蛋白質量比為2∶1，乳化液的pH為8.0，此時糖基化蛋白的乳化活性為0.83，是其相同條件下對照樣的1.66倍。

2）以乳化穩定性為指標，確定大豆分離蛋白-葡聚糖干法改性最佳工藝條件為：糖-蛋白（3∶1），反應時間24 h，反應溫度70℃，乳化液的pH 8.0，此時糖基化蛋白的乳化穩定性為59.28，是其相同條件下對照樣的2.06倍。

3）SDS-PAGE結果證實大豆分離蛋白經干法糖基化改性生成了糖基化蛋白。

[1]楊凱,童正明,戴杏云.大豆分離蛋白的性質分析與改性研究[J].食品研究與開發,2006,27(7):87-89

[2]Chee-Yuen Gan,Lai-Hoong Cheng,Azhar Mat Easa.Physicochemical properties and microstructures of soy protein isolate gels produced using combined cross-linking treatments of microbial transg - lutaminase and Maillard cross-linking[J].Food research international,2008(41):600-605

[3]Nakamura S,Kato A,Kobayashi K.New antimicrobial characteristics of lysozyme-dextran conjugate[J].Journal of agricultural and food chemistry,2000,39:647-650

[4]Moreno F,Lopez-Fandino R,Olano A.Characterization and functional properties of lactosyl caseinomacropeptide conjugates[J].J Agric Food Chem,2002,50(18):5179-5184

[5]Akio Kato,Youko Sasaki,Ritsuko Furuta,et al.Functional protein - polysaccharide conjugate prepared by controlled dry-heating of ovalbumin-dextran mixtures[J].Agric Biol Chem,1990,54(1):107-112

[6]Tang S,Hrttiarachchy N S,Horax R E,et al.Physicochemical properties and functionality of rice bran protein hydrolyzate prepared from heat-stabilized defatted rice bran with the aid of enzymes[J].Journal of food science,2003,68(1):152-157

[7]周先碗,胡曉倩.生物化學儀器分析與實驗技術[M].北京:化學工業出版社,2002:316-321

[8]Zheng Heng-Guang,Yang Xiao-Quan,Tang Chuan-He,et al.Preparation of soluble soybean protein aggregates(SSPA)from insoluble soybean protein concentrates (SPC)and its functional properties[J].Food research international,2008(41):154-164

[9]劉娟,王璋,盧蓉蓉.酪蛋白-葡聚糖接枝改性研究[D].江南大學,2008

[10]Tang Chuan-He,Ma Ching-Yun.Heat-induced modications in the functional and structural properties of vicilin-rich protein isolate from kidney(Phaseolus vulgarisL.)bean[J].Food chemistry,2009(115):859-866

[11]Diftis V Kiosseoglou.Physicochemical properties of dry-heated soy protein isolate-dextran mixtures[J].Food chemistry,2006(96):228-233

[12]Scaman C,Nakai S,Aminlari M.Effect of pH,temperature and sodium bisufite or cysteine on the level of Maillard-based conjugation of lasozyme with dextran,galactomannan and mannan[J].Food chemistry,2006(99):368-380