獼猴桃根提取物體外抗氧化作用的研究

楊艷杰，何弘水

（漯河醫學高等專科學校，河南 漯河 462002）

氧在生物體內通過單電子還原產生化學性質活潑的物質稱為活性氧，包括超氧陰離子自由基（·O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（·OH）等[1]。活性氧的半衰期很短，但它們可以與多元不飽和脂肪酸作用，造成脂質過氧化。脂質過氧化是造成生物體氧化損傷的主要原因。不飽和脂肪酸是生物膜的基本組成成分，極易被活性氧氧化損傷，造成生物膜結構和功能的破壞，從而誘發多種慢性疾病[2]。因此，消除自由基、抑制脂質過氧化已成為生命科學領域的一項重要課題。本實驗從清除DPPH自由基、清除·O2-、清除H2O2，抑制·OH、還原力等方面比較獼猴桃根提取物的抗氧化效果，為獼猴桃根生物活性成分的綜合開發利用提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

HP8453紫外可見分光光度計：美國惠普；pH25-S型酸度計：北京華瑞博遠科技公司；800型離心沉淀器：河南斯泰儀器有限公司。

1.2 試劑

還原性輔酶Ⅰ（NADH），二甲基酚嗪硫酸鹽（PMS），氮四唑藍（NBT），二苯基苦基苯（DPPH），菲洛嗪，氯化亞鐵，氯化鐵，亞鐵氰化鉀（K4[Fe（CN）6]），鄰菲咯啉，過氧化氫，三氯乙酸（CCl3COOH），鉬酸銨[（NH4）2MoO4]，硫代硫酸鈉（NaS2O3），碘化鉀，淀粉，VC，硫脲，乙酸乙酯，無水乙醇。試劑均為分析純，實驗用水為重蒸餾水（ddH2O）。

2 方法與結果

2.1 樣品（獼猴桃根提取液）制備

獼猴桃根10 kg切碎，80℃以下烘干至水分小于10%，粉碎小于20目，用乙醇（65%）45℃以下回流提取3次，提取液于50℃減壓濃縮，得約300 g深黃色流浸膏，然后取200 g膏狀物，加入適量蒸餾水，攪成糊狀混合液，依次用乙酸乙酯萃取3次（每次500 mL），合并提取液，減壓回收溶劑得獼猴桃根提取固體，用65%乙醇精確配制成濃度分別為 5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0μg/mL 和 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 的樣品（ERHM）溶液。

2.2 ERHM對DPPH自由基的消除作用

同時計算清除DPPH的半數有效濃度EC50。用VC作對照，進行平行實驗。ERHM對DPPH有較強的清除作用，且呈現濃度依賴性。VC的EC50為7.2μg/mL，ERHM 的 EC50為 8.03μg/mL。

2.3 ERHM對超氧陰離子（·O2-）的清除作用

參考Liu等[4]的方法檢測ERHM對超氧陰離子的清除能力。取不同濃度的ERHM溶液0.3mL分別加入由120μmol/L的PMS、936μmol/L的NADH、300μmol/L的NTB溶液（均用0.1 mol/L的pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液配制）各0.75 mL所建立的反應體系中，混勻，室溫靜置反應10 min，于560 nm處測定吸光度值A0；以65%乙醇代替ERHM，560 nm處測定A0；以磷酸鹽緩沖溶液代替PMS溶液，在560 nm處測定A2；65%乙醇調零。均平行測定3次。對超氧陰離子清除率和EC50的計算方法同前。ERHM對超氧陰離子具有較強的清除作用，在 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 時，清除率分別是 35.57%、48.65%、66.74%、72.11%、76.18%，EC50為1.28 mg/mL。

2.4 ERHM對羥基自由基（·OH）的抑制能力

參考Fenton反應體系[5]檢測ERHM抑制羥基自由基（·OH）的能力。反應體系組成：60μL 1.0 mmol/L Fe2+溶液，90μL 1.0 mmol/L 鄰菲咯啉溶液，150μL 0.12%H2O2溶液，2.4 mL pH=7.8的磷酸鹽緩沖溶液，分別加入不同濃度的ERHM溶液300μL，混勻，室溫反應20 min，510 nm處測定A1；65%乙醇代替抗氧化劑，測定A0；pH=7.8的磷酸鹽緩沖溶液代替鄰二氮菲，測定A2，65%乙醇調零。均平行測定3次。清除率及EC50計算方法同前。結果見圖2。

在0～4 mg/mL，ERHM抑制羥基自由基的能力呈現濃度依賴性。ERHM濃度達5.0 mg/mL時，抑制羥基自由基（·OH）能力可達69.4%，其EC50為1.57 mg/mL。

2.5 還原力比較

參考Oyaizu方法[6]依次加入0.75 mL磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.6）、0.75 mL 1%的 K4[Fe（CN）6]、0.75 mL 不同濃度的ERHM溶液，混勻，50℃水浴30 min，冰水浴冷卻，加入0.75 mL 1%CCl3COOH，4℃下離心10 min（3000 r/min）。取上清液1.5 mL，加入 ddH2O 1.5 mL、1%FeCl30.75 mL，混勻，室溫靜置 10 min，700 nm 處測定A1；以ddH2O代替ERHM溶液，測定A0；ddH2O調零。均平行測定3次。以110 mg/mL VC在700 nm處的A為標準，按下式計算相對還原力：RP=×100%，結果見圖3。

同時計算ERHM還原力的EC50。ERHM還原力較強，其EC50為0.28 mg/mL，約是VC（EC50為0.08 mg/mL）的3.5倍。

2.6 ERHM對H2O2的消除能力

H2O2是強氧化劑，且易透過細胞膜，并引起氧化損傷。本實驗采用置換滴定法檢測H2O2濃度。取不同濃度的ERHM溶液各1.0 mL分別與1.0 mL 0.1 mol/mL H2O2混合，加入 2 滴 3%的（NH4）2MoO4、2 mol/L H2SO410 mL、1.8 mol/L KI 7.0 mL，用 0.005 mol/L NaS2O3滴定，待體系變黃，加入1 mL淀粉溶液，繼續滴定到無色即為終點。滴定樣品試劑的體積為V1，滴定H2O2所用體積為V0。平行滴定3次。計算清除率100%。結果見圖4。

結果顯示樣品ERHM對過氧化氫具有一定的消除作用，在濃度為100μg/mL時對過氧化氫的清除率為42%，比VC要小（同樣條件下VC清除率為91%）。

3 討論

本實驗結果表明，ERHM具有較強的還原力，這與較強抑制羥基自由基的產生及消除過氧化氫有關，同時也具有消除DPPH和超氧陰離子等活性氧的能力。實驗結果證明了ERHM的多方面抗氧化活性，且隨其濃度增加而增大。所以，ERHM有效成分具有較為顯著的抗氧化作用。

現代研究已經證實，在生命活動的氧化代謝過程中會不斷產生各種自由基，其中超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基等引起的細胞損傷過程是微粒體脂質過氧化和多不飽和脂肪酸（PUFA）氧化變性的主要原因[2]。當PUFA遭受到氧化損傷時細胞即失去完整性，破壞了鑲嵌于膜系統上的許多酶的空間構型，使得酶的空隙擴大、通透性增加，出現退行性變化，從而使內質網膜、線粒體膜、溶酶體膜等生物膜系統的鑲嵌狀態發生變化，導致廣泛損傷和病變。自由基一般都不穩定，壽命很短，檢測自由基的清除能力是評價抗氧化物質抗氧化活性的重要方法。還原力反映了一種物質作為電子供體的能力，藥物還原力和捕獲過氧化氫能力的大小在一定程度上反映了其預防性抗氧化功能的強弱。

[1]楊宏杰,陳咸川,鄭敏,等.黃芪和丹參清除自由基能力的研究[J].復旦學報:自然科學版,2003(6):935-938

[2]崔劍,李兆隴,洪嘯吟,等.自由基生物抗氧化與疾病[J].清華大學學報:自然科學版,2000(6):9-12

[3]Amarow icz R,N aczk M.Shahidi F1Antioxidant activity of various fractions of non-tanin pheno lics of cano lahulls[J].J A gric Food Chem,2000,48:2755-2759

[4]Liu F,OoiV E C,Chang S T.Free radicals scavenging activity of mush room polysaccharide extracts[J].Life Sci,1997,60:763-771

[5]Yu W L,Zhao Y P,Shu B.The radical scavenging activitiesof Radix Puerariae isoflavonoids:A chem ilum inescencestudy[J].Food Chem,2004,86:525-529

[6]Oyaizu M.Studies on products of browning reactions:antioxidant activities of products of browning reaction prepared fromglucose amine[J].J P J Nutr,1986,44:307-315