黃皮果提取物的解酒及護肝作用研究

黃澤偉，程江鳳，蔡珊，林美金，盧瑞榮，吳科鋒，李文德，3，*，黃韌

（1.廣東醫學院第一臨床學院，廣東 湛江 524023；2.廣東天然藥物研究與開發重點實驗室，廣東 湛江 524023；3.廣東醫學院藥理學教研室，廣東 湛江 524023；4.廣東省實驗動物監測所，廣東 廣州 510260）

長期過量或一次性大量攝入酒精引起的酒精中毒及并發癥已嚴重影響了人們的正常生活，據統計在歐美國家，酒精中毒是位列心血管疾病、腫瘤之后占第3位的公共衛生問題，美國一般人群的終生患病率高達18%，且有超過20%的入院病人是由于濫用酒精致的急性中毒所引起的[1-2]。我國是酒精的生產和消費大國，由飲酒引起的酒精中毒患者數量巨大，因此開發有效防醉酒、醒酒及護肝的藥物及保健食品受到醫藥及食品行業的普遍重視。蕓香科黃皮屬黃皮（Clausena lansium），果實具有健脾開胃、行氣解郁之功效，現代藥理學研究也發現了其中的有效成分黃皮酰胺有抗衰老、保肝解毒和促智的作用[3-5]。本研究擬通過小鼠酒精中毒動物模型觀察黃皮果提取物在防醉及保肝方面的作用,并為將其開發為解酒護肝產品提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

健康ICR種小鼠，雌雄各半，體重24 g～28 g，均為清潔動物，檢疫合格，由廣東省實驗動物中心提供。52°二鍋頭白酒為北京紅星酒業有限公司產品；752N紫外可見分光光度計：上海精科；T－500型電子天平：常熟雙杰測試儀器；臺式離心機：上海安亭科學儀器公司；ALT、AST、ADH酶試劑盒：南京建成生物工程研究所；酶標儀：BIO-TEX ELX800。

1.2 方法

1.2.1 黃皮果提取物的制備

烘干、粉碎后稱取適量黃皮果，分別以60℃和90℃，水煎3次，按1∶1混合，并濃縮成含生藥量1 g/mL供試品備用，用時分別配成含生藥5、10 g/kg進行實驗。

1.2.2 小鼠給酒劑量的選擇

36只ICR小鼠隨機分為6組，每組6只，雌雄各半，實驗前禁食12h，自由飲水，實驗時分別從0.11mL/10g～0.16 mL/10 g不同劑量的白酒（52°紅星二鍋頭）分別對6組小鼠進行灌胃，每組6只。觀察記錄小鼠醉酒數量。醉酒與否以翻正反射（lost of righting reflex,LOR）是否消失為判斷指標,小鼠灌酒后,將其背向下輕輕放在動物籠內，若動物背向下的姿勢保持20 s以上，則認為翻正反射消失，即為醉酒，反之為不醉。

1.2.3 黃皮果對小鼠醉酒的影響

選取小鼠40只，雌雄各半，隨機分為4組，每組10只,隨機分成：正常組、模型組、黃皮果提取物低劑量組（生藥5 g/kg）、高劑量組（生藥10 g/kg）。各實驗組給予相應的藥物30 min后，空白組灌以等量的生理鹽水,其余各組分別灌胃實驗用酒0.12 mL/10 g，分別記錄小鼠醉酒數量、攀附時間（灌服酒后，然后立即將小鼠放在垂直的金屬網上，觀察小鼠活動情況并記錄各小鼠攀附在網上的時間），醉酒潛伏時間（從灌酒到翻正反射消失的時間）及持續醉酒時間（從翻正反射消失到清醒的時間）。

1.2.4 生化指標檢測

灌酒6 h后用眶靜脈采血，處死小鼠，3000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃冰箱保存，按照試劑盒說明方法檢測血中ALT、AST、ADH。

1.2.5 肝組織病理變化觀察

處死小鼠后迅速剖腹取出肝臟，取部分肝組織用10%福爾馬林固定36 h后，HE染色，觀察小鼠肝組織形態。

1.2.6 統計學處理

2 結果

2.1 食用酒精灌胃制備小鼠酒精中毒動物模型

不同酒精攝入量對小鼠醉酒狀況的影響見表1。

表1 不同酒精用量對小鼠醉酒情況的影響(n=6)Table 1 Effect of different dosage of alcohol on the rate of drunkenness(n=6)

分別給小鼠灌胃白酒 0.11、0.12、0.13、014、0.15、0.16 mL/10 g，記錄30 min內小鼠醉酒數，實驗結果表明0.12 mL/10 g組6只全部醉倒而都沒有醉死，因此0.12 mL/10 g為較佳致醉量。

2.2 黃皮果提取物對酒精中毒小鼠醉酒效果的影響

黃皮果提取物各劑量組防醉結果見表2。

表2 黃皮果提取物對小鼠醉酒率、醉酒潛伏時間、持續醉酒時間(n=10)Table 2 Effect of the astract from FCW on the rate of drunkenness,latent time of drunkenness and durative time of drunkenness(n=10)

與模型組相比，灌酒前30 min給予不同濃度的黃皮果提取物,均可降低小鼠醉酒發生率、延長攀附時間及縮短小鼠持續醉酒時間，且有統計學意義（P<0.05），盡管給藥組均發現可明顯延長小鼠醉酒潛伏時間，僅高劑量組對延長醉酒潛伏時間的差異有顯著性（P＜0.05）。

2.3 黃皮果提取物對小鼠血清中ALT、AST、ADH水平的影響

黃皮果提取物各劑量組對小鼠血清中ALT、AST、ADH水平的影響見表3。

表3 黃皮果提取物對小鼠血清中ALT、AST、ADH水平的影響(n=10)Table 3 Effect of the extract from FCW on the level of ALT,AST and ADH in serum(n=10)

與正常組相比，模型組ALT和AST水平明顯升高（P<0.05），說明大劑量的酒精攝入可使肝功能受損。黃皮果提取物高、低劑量組與模型組相比均可明顯降低小鼠血清ALT水平（P<0.05），但對AST的水平影響不明顯，同時各實驗組均可升高ADH水平且差異有顯著性（P<0.05）。

2.4 黃皮果提取物對小鼠肝組織病理變化的影響

HE染色光鏡下觀察不同組別小鼠的肝組織形態的結果見圖1。

圖1 黃皮果提取物對小鼠急性酒精性肝損傷的影響（HE染色×400）Fig.1 Effect of the astract from FCW on the acute liver injury

結果顯示：正常組小鼠肝細胞無明顯變性、壞死，無炎細胞浸潤；模型組小鼠肝臟可見肝小葉中央靜脈、匯管區周圍有大量肝細胞水樣變，肝細胞脂肪樣變明顯，可見炎細胞浸潤；與模型組相比,黃皮果提取物高劑量組與低劑量組肝細胞水樣變、脂肪樣變以及炎細胞浸潤均有明顯改善，其中以高劑量組效果更顯著。

3 討論

醉酒狀態是酒精中毒的一個特征指標，是由于過量攝入乙醇，超過了機體氧化酒精的速度，而產生的蓄積中毒。目前已證實乙醇及其代謝產物乙醛具有強烈的脂質過氧化反應和毒性，嚴重損傷肝細胞及心肌細胞，導致肝功能及心肌功能下降[6-7]。因此，通過降低乙醇在體內的蓄積或加快乙醇在體內的代謝可防止酒精中毒的發生，也是解酒防醉的治療原則。實驗結果顯示，與模型組相比，酒前灌黃皮果提取物可顯著降低小鼠醉酒率、持續醉酒時間、延長醉酒潛伏時間及小鼠的攀附時間，這說明黃皮果提取物有明顯的防醉效果。

肝損傷的一個重要標志就是生化指標的變化，正常肝內ALT含量約為血中的100倍，當肝臟實質性損害時，只要有1%的肝細胞壞死，就可使血清活性增加1倍；當細胞膜通透性增加時，即使無壞死，肝細胞內的轉氨酶也可以順濃度差而釋放入血。因此轉氨酶是肝細胞損害的敏感標志，也是乙醇所致肝損傷最敏感的指標[7]。本實驗結果顯示,模型組中ALT比正常組顯著升高，而各劑量黃皮果提取物組可使ALT有明顯的下降，表明對肝細胞有保護作用，這與HE染色觀察到的結果相符，其中模型組肝細胞出現明顯的變性、壞死區域，而黃皮果提取物低、高劑量組肝細胞形狀無明顯變性壞死區域。而AST則以心肌含量最高，其次為肝臟，只有當肝細胞受到明顯損傷，尤其是線粒體損傷時才釋放到血中，因此AST提示肝細胞損傷嚴重[8]。實驗中測得的用藥組AST水平與模型組相比降低不如ALT明顯，是否說明酒精中毒不僅引起肝損傷，同時也損傷了心肌細胞導致大量的AST釋放入血，而提取物對心臟功能無明顯保護作用，這需要進一步實驗證實。

乙醇脫氫酶（ADH）是人體分解乙醇的主要酶類，主要分布于肝臟，ADH分解酒精的速度主要與ADH的量有關[9]，血清中ADH的水平可以反映體內酒精代謝的情況，目前大部分解酒藥物也正是基于這一機制開發的。與正常組比較，模型組小鼠肝組織ADH活性有所升高，而低、高劑量組與模型組相比的ADH有明顯的上升，表明黃皮果提取物組可以誘導ADH活性增強、促進乙醇的代謝,加速乙醇的排除體外,降低血清乙醇濃度。這可能與黃皮果提取物內存在能增強ADH活性的相關物質如黃皮酰胺類等，但其相關機制尚未明確，需作進一步研究。

[1]McCarty C A,Ebel B E,Garrison M M,et al.Continuity of binge and harmful drinking from late adolescence to early adulthood[J].Pediatrics,2004,114(3):714-719

[2]Malyutina S,Bobak M,Kurilovitch S,et al.Trends in alcohol intake byeducation and marital status in urburn population Russian between mid 1980s and the mid1990s[J].Alcohol alcoholism,2004,39(1):64-69

[3]潘瑞樂,朱兆儀.黃皮屬藥用植物研究進展[J].國外醫藥-植物藥分冊,1990,5(6):243-247

[4]Liu G T,Li W X,Chen Y Y,et al.Heptaoproteetive action of nine constituents isolated from the leaves of Clausena lansium in mice[J].Drug Develop Res,1996,39(2):174-178

[5]張均田,段文貞,劉少林,等.(-)黃皮酰胺的抗老年癡呆作用[J].醫藥導報,2001,20(7):403-404

[6]E Wilson,W S Waring.Severe hypotension and hypothermia caused by acute ethanol toxicity[J].Emerg Med J,2007,24(7):1-2

[7]Angela Dolganiuc,Gyongyi Szabo.In vitro and in vivo models of acute alcohol exposure[J].World J Gastroenterol,2009,15(10):1168-1177

[8]喬光彥.病毒性肝炎與肝功能異常[J].小兒急救醫學,2004,11(6):418-420

[9]Luisa Vonghia,Lorenzo Leggio,Anna Ferrulli,et al.Acute alcohol intoxication[J].European Journal of Internal Medicine,2008,19:561-567