靈武長棗采后主要病原真菌的鑒定

任玉鋒，馬愛瑛，劉雅琴，韓培杰

（北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏 銀川 750021）

靈武長棗（Zizphus jujubamill cv.lingwuchangzao）是寧夏靈武有地方特色的優良棗品種，其個大、色艷、果肉致密酥脆、酸甜適口，鮮棗含糖量高，VC含量達3 g/kg～4 g/kg，是集營養、保健于一體的優質果品，是寧夏優勢特色水果之一。但靈武長棗與其他棗類一樣，在自然條件下貯藏比較困難，鮮銷期只有半個月左右，在貯藏中因真菌病害侵染而導致的腐爛率達30%～40%[1]，嚴重制約了寧夏紅棗產業的發展。甘瑾等從貯藏的靈武長棗中分離并采用形態學的方法鑒定出了貯藏過程中引起腐爛病害的四種主要病原真菌[1]。本試驗以靈武長棗為主要研究對象，分離和篩選出引起靈武長棗采后腐爛的主要致腐病原真菌，并用形態學和分子生物學的方法相結合對之進行鑒定,為進一步研究靈武長棗采后生理及保鮮技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基；（PDA培養基）：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1000 mL。

1.1.2 主要儀器設備

立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-50KBS型）：上海申安醫療器械廠，上海；恒溫恒濕培養箱（HWS智能型）：寧波江南儀器廠，寧波；雙人單面潔凈工作臺（SW-CJ-2FD）：蘇州蘇潔凈化設備有限公司，蘇州；光學顯微鏡（CX31RTSF）：Olympus，日本，等。

1.1.3 實驗材料

靈武長棗：產自寧夏靈武市靈河鎮二道溝村棗園；引物：由 TaKaRa公司合成；Tap酶、dNTP：均購自TaKaRa公司。

1.2 靈武長棗采后主要病原真菌的分離

參照甘瑾等的方法分離靈武長棗采后主要病原真菌[1]。

1.3 靈武長棗采后主要病原真菌的鑒定

1.3.1 形態學的鑒定

根據病害癥狀、菌落形態及菌絲、孢子、孢子器等的特征來確定病原菌的種屬。

1.3.2 靈武長棗主要病原真菌rDNA-ITS序列分析

1.3.2.1 總DNA的提取

參照莊得鳳等的CTAB方法提取菌株的總DNA[2]。

1.3.2.2 rDNA-ITS序列的擴增

擴增 ITS區（以 ITS1：5’-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3’和 ITS4：5’-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3’為引物）的 rDNA 序列，反應體系 50μL（5μL PCR buffer（10×PCR buffer），4μL dNTPs（2.5 mmol/L），1μL模板 DNA，上下游引物各 1μL，0.25μL Taq，加 ddH2O至50μL。PCR程序：94℃預變性5 min后，30個循環包括 94℃50s，51℃50s、72℃2min，72℃延伸 10min。反應完成后，-20℃保存備用，0.8%瓊脂糖電泳檢測。將PCR產物純化后直接測序（測序由大連寶生物公司完成）。將獲得的基因序列在NCBI數據庫進行BLAST。

2 結果與分析

本實驗共分離到4種典型菌株，分別記錄為A、B、C、D。

2.1 靈武長棗采后主要病原真菌的形態學鑒定結果

將從貯藏的靈武長棗果實上分離出A、B、C、D 4種病原真菌，挑取各菌落少許到載玻片上，制片并用顯微鏡觀察、測量、拍照，根據各病原菌的形態特征對其進行鑒定。

2.1.1 病原菌A形態及培養性狀觀察

病原菌A形態及培養性狀觀察，見圖1。

由圖1的A1、A2、A3、A4可見，病原菌A菌落黑灰色；有發達的假根和匍匐枝，菌絲無隔，孢囊梗較長，自假根伸出單根而不分枝，末端突入孢囊內與孢囊相接，1～10枝叢生于假根上；孢子囊為球形，孢囊孢子形狀不規則，孢子大小 10μm～20μm，依據文獻[1，3]初步鑒定為黑根霉（Rhizopus stolonifer），是長棗采后最嚴重的致病菌。

圖1 病原真菌A形態及培養性狀Fig.1 Form and culture character of pathogenic fungi A

2.1.2 病原菌B形態及培養性狀觀察

病原菌B形態及培養性狀觀察，見圖2。

圖2 病原真菌B形態及培養性狀Fig.2 Form and culture character of pathogenic fungi B

由圖2的B1、B2、B3、B4可見，病原菌B菌落墨綠色；菌絲有隔單核，分生孢子梗直立，頂端1至多次分枝呈掃帚狀，分枝上產生3輪不對稱的瓶狀小梗，其頂端著生成串的分生孢子，球形，呈念珠狀，一般5～20個成串相連，孢子直徑 2μm～3μm。依據文獻[1，3-4]初步鑒定為青霉屬（Penicillium sp.）的真菌。

2.1.3 病原菌C形態及培養性狀觀察

病原菌C形態及培養性狀觀察，見圖3。

由圖3的C1、C2、C3、C4可見，病原菌C菌落成圓形灰褐色，邊緣不規則白色；菌絲有隔；分生孢子梗叢生，分生孢子有倒棍棒形、卵形或橢圓形，常帶有短圓形喙，分生孢子一般有橫隔，少數有縱隔，孢子大小 30μm×10μm；依據文獻 [1，3]初步鑒定為鏈格孢[Alternaria alternata（Fr.）Keissl]。

圖3 病原真菌C形態及培養性狀Fig.3 Form and culture character of pathogenic fungi C

2.1.4 病原菌D形態及培養性狀觀察

病原菌D形態及培養性狀觀察，見圖4。

圖4 病原真菌D形態及培養性狀Fig.4 Form and culture character of pathogenic fungi D

由圖4的D1、D2、D3、D4可見，病原菌D菌落邊緣白色，有同心圈紋，表面有小水粒；菌絲有隔，分生孢子梗直立，不分枝，分生孢子1～2個頂生。分生孢子洋梨形，雙細胞分隔處略縊縮，孢子基部有一乳頭狀突起。被病原菌侵染的棗果初期為白色，后期變為粉紅色，棗果表皮干燥。依據文獻[1，3]初步鑒定為粉紅聚端孢[Trichoderma roseum（Pers.）Link]。

2.2 靈武長棗采后主要病原真菌rDNA-ITS序列分析

經瓊脂糖凝膠電泳檢測，分離得到的4種真菌的PCR反應體系產物均為單一條帶，如圖5所示。

圖5 ITS擴增電泳圖Fig.5 了Amplification Electrophoretogram of ITS

PCR產物直接純化測序后，序列測定片段產度分別為：ITS序列PCR擴增條帶大小約700 bp。把所得到序列提交到GeneBank數據庫，進行BLAST比較，A 的 ITS序列與 Rhizopus stolonifer（AM933544）同源性為100%、B的ITS序列與penicillium crustosum（HQ026728）同源性為99%、C的ITS序列與Alternaria alternata（GQ121322）同源性為 99%、D 的 ITS序列與Trichothecium roseum（HQ115655.1）同源性為99%。

3 結論

本實驗采用形態學和rDNA-ITS序列分析法相結合的方法，從采后貯藏的靈武長棗中分離鑒定出4種主要病原真菌進行鑒定。真菌rDNA序列分析用于真菌系統分類通常通過多聚酶鏈式反應（PCR）技術實現。PCR技術在真菌分類與鑒定中有獨特的優點，如快速、靈敏、需樣品量少等。RENSKE等[5]認為真菌通過rDNA-ITS區域比對，序列相似性大于99%，鑒別為同種；序列相似性大于95%且小于99%，鑒別為相同屬；序列相似性小于95%，鑒別為同科，因此結合菌株形態學特征，可以初步鑒定此4株病原真菌分別為：黑根霉（Rhizopus stolonifer）、皮落青霉（penicillium crustosum）、鏈格孢[Alternaria alternata（Fr.）Keissl]和粉紅聚端孢[Trichoderma roseum（Pers.）Link]，其中從貯藏的靈武長棗中分離出鏈格孢和粉紅聚端孢已有資料報道[1]，而黑根霉、皮落青霉為在靈武長棗中首次分離得到病原真菌。

[1]甘瑾,唐文林,潘祿,等.靈武長棗采后病原菌的分離及天然抗菌物質的篩選[J].西北農林科技大學學報:自然科學版,2007,35(10):81-86

[2]莊得鳳,曹后男,周蘭,等.長白山杜鵑花基因DNA提取及RAPD體系的建立[J].湖北農業科學,2008,47(3):17-20

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