一株紅樹(shù)林真菌胞外多糖免疫增強(qiáng)作用研究

裴華，牛莉娜，林英姿，王華民，王永霞，鄔強(qiáng)，夏乾峰

（海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南 海口 571101）

紅樹(shù)林位于海洋和陸地之間的潮間帶，該區(qū)域土壤具有沼澤化、鹽漬化、強(qiáng)酸性和有機(jī)質(zhì)含量高等特點(diǎn)。生長(zhǎng)于此的真菌等微生物種類(lèi)豐富，目前已分離鑒定的紅樹(shù)林真菌超過(guò)200余種，已成為海洋真菌的第二大類(lèi)群。相對(duì)與陸生真菌，生長(zhǎng)于紅樹(shù)林特殊環(huán)境的真菌可能存在特殊的分子適應(yīng)機(jī)制，其代謝產(chǎn)物的表達(dá)水平與類(lèi)型皆有可能獨(dú)特新穎[1]。

本研究以海南東寨紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)作為土壤采樣地點(diǎn),研究該環(huán)境中真菌發(fā)酵上清中活性產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)活性。最終課題組獲得了一株產(chǎn)免疫調(diào)節(jié)活性胞外多糖的真菌菌株，初步鑒定為淡紫色擬青霉。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來(lái)源

土壤樣本采集于海南東寨紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)，距

地表5 cm～20 cm采樣。采集后放入無(wú)菌塑料封口袋內(nèi)，迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣本處理。

1.1.2 人外周血單個(gè)核細(xì)胞

外周血采集自健康成年男性，無(wú)菌條件下聚蔗糖泛影葡胺密度梯度離心法分離獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞[2]。

1.1.3 昆明種小鼠

昆明種小鼠購(gòu)買(mǎi)自廣州省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；綿羊紅細(xì)胞、雞紅細(xì)胞均獲取自海南省藥物安全性評(píng)價(jià)中心。

1.1.4 其他主要試劑

發(fā)酵培養(yǎng)基采用大豆粉玉米粉培養(yǎng)基（大豆粉10.0g，玉米粉 10.0 g，可溶性淀粉 5.0 g，KH2PO40.5 g，50%陳海水定容至1 L，調(diào)pH 7.2）。查氏培養(yǎng)基、分離培養(yǎng)基采用陳海水馬丁培養(yǎng)基（50%陳海水配置、0.1%氯霉素）：購(gòu)買(mǎi)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。香菇多糖購(gòu)買(mǎi)自南京康海藥業(yè)有限公司：國(guó)藥準(zhǔn)字H10950078。ConA購(gòu)自Sigma公司，RPMI1640培養(yǎng)液：購(gòu)自GIBCO公司。新生牛血清：購(gòu)自杭州四季青工程材料有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 真菌菌株的分離純化

稱取10 g土壤樣本，在無(wú)菌操作下加入100 mL無(wú)菌陳海水的三角瓶中，充分振蕩混勻后，進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)颖旧锨逯苽涑?0-2至10-4不同稀釋度，各稀釋度取100μL涂布于分離培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，對(duì)平板上不同形態(tài)菌落進(jìn)行編號(hào)并觀察記錄[3]。

1.2.2 EPS的獲取

挑取單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵5d（250r/min，28℃），發(fā)酵液離心后（3000 r/min，4℃，20 min）取上清。發(fā)酵上清4℃10000 r/min離心20 min后，上清液以3倍體積冰乙醇4℃沉淀。24 h后4℃條件下4520 g離心15 min后，沉淀溶于去離子水中。鏈蛋白酶+Sevag法聯(lián)合脫蛋白[4]后，-50℃條件下凍干48 h后備用。

1.2.3 人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖刺激實(shí)驗(yàn)（MTT法）

無(wú)菌條件下分離獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)每孔中加入人外周血單個(gè)核細(xì)胞1×105個(gè)。在待測(cè)樣本孔中加入含5 mg/mL EPS的RPMI1640培養(yǎng)液100μL，陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)加入含5mg/ml刀豆蛋白 A（ConA）RPMI1640 培養(yǎng)液 100μL，正常對(duì)照孔內(nèi)加入RPMI1640培養(yǎng)液100μL，各組培養(yǎng)液中新生牛血清含量均為10%，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔。37℃，5%CO2培養(yǎng)72 h后，加入含5 mg/mL MTT基礎(chǔ)培養(yǎng)液20μL，37℃，5%CO2培養(yǎng)。4 h后棄培養(yǎng)上清，每孔中加入100μL二甲亞砜，振蕩器振搖10 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀492 nm波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，630 nm參比波長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次[5]。

1.2.4 動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用上述方法從菌株發(fā)酵液中獲得大量胞外多糖凍干粉末后，以昆明種小鼠進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)活性產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物免疫功能影響情況[6]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為昆明種小鼠，雌雄隨機(jī)，8～10 周齡，體重（20±3.0）g。隨機(jī)將小鼠分為3組，每組20只，實(shí)驗(yàn)組以生理鹽水溶解胞外多糖凍干粉末（50 mg/kg）灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組以生理鹽水溶解香菇多糖（50 mg/kg）灌胃，正常對(duì)照組灌胃生理鹽水，灌胃體積1 mL，1次/d，連續(xù)28 d。

1.2.4.1 臟體指數(shù)測(cè)定

末次給藥后，禁食不禁水12 h，分別稱重。脫頸椎處死后剝離脾臟、胸腺稱重并計(jì)算脾臟/體重和胸腺/體重比值。

1.2.4.2 遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)測(cè)定

末次給藥后，動(dòng)物致敏前腹部脫毛，以1%二硝基氟苯（DNFB）5μL涂于小鼠腹部脫毛處，連續(xù)致敏4 d后右耳雙面涂以DNFB 10μL，24 h后處死小鼠，打孔器摘取左、右耳片各8 mm，稱重。

1.2.4.3 血清溶血素抗體生成測(cè)定（HC50）

小鼠于首次給藥后23 d，每只腹腔注射0.2 mL 4%（體積分?jǐn)?shù)）的綿羊紅細(xì)胞致敏。于末次給藥后12 h，摘眼球收集血液。分離血清，按體積比1∶200生理鹽水稀釋。測(cè)定小鼠血清溶血素含量，計(jì)算半數(shù)溶血值（HC50）。

1.2.4.4 巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定

末次給藥后于小鼠腹腔注射2%溶解淀粉溶液1 mL，次日腹腔注射5%雞紅細(xì)胞0.5 mL，40 min后處死小鼠，取腹腔液涂片，瑞氏-姬姆薩染色，油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)MФ中已吞噬雞紅細(xì)胞的MФ數(shù)及未吞噬數(shù)。

1.2.5 菌株分類(lèi)鑒定

對(duì)菌株P(guān)H0016進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定；同時(shí)對(duì)菌株ITS序列進(jìn)行分析，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[7]。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離、篩選、刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果

從東寨紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)土壤樣本中共分離得到真菌536株，其中菌株P(guān)H0016的EPS促進(jìn)人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖較為突出和穩(wěn)定，被應(yīng)用于后續(xù)研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。相比于正常對(duì)照，菌株P(guān)H0016所產(chǎn)生的EPS在體外對(duì)于人外周血單個(gè)核細(xì)胞具有較顯著的刺激增殖作用（P<0.05）。

表1 菌株P(guān)H0016EPS對(duì)單個(gè)核細(xì)胞增殖的影響()Table1 Effect of EPS from strain PH0016 on proliferation of PBMC

表1 菌株P(guān)H0016EPS對(duì)單個(gè)核細(xì)胞增殖的影響()Table1 Effect of EPS from strain PH0016 on proliferation of PBMC

注：*與正常對(duì)照組比較，P<0.05。

2.2 臟體指數(shù)

根據(jù)表2所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株P(guān)H0016所產(chǎn)生的EPS小鼠灌胃28 d后，相比于正常對(duì)照，小鼠的脾臟/體重、胸腺/體重的臟體指數(shù)有顯著性提高（P<0.05）。

2.3 遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)

根據(jù)表2所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，菌株P(guān)H0016所產(chǎn)生的EPS可顯著促進(jìn)昆明種小鼠機(jī)體對(duì)DNFB致敏的反應(yīng)性，相比于正常對(duì)照，經(jīng)DNFB致敏后耳片重量明顯增加（P＜0.05）。

表2 菌株P(guān)H0016胞外多糖對(duì)小鼠臟體指數(shù)及遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響()Table 2 Effect of EPS from strain PH0016 on ratio of organs to body and DTH

表2 菌株P(guān)H0016胞外多糖對(duì)小鼠臟體指數(shù)及遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響()Table 2 Effect of EPS from strain PH0016 on ratio of organs to body and DTH

注：*與正常對(duì)照組比較，P<0.05。

2.4 血清溶血素生成測(cè)定（HC50）

經(jīng)菌株P(guān)H0016胞外多糖連續(xù)灌胃后，相比正常對(duì)照HC5021.54±3.27，實(shí)驗(yàn)組HC50有顯著提高達(dá)到124.36±32.56（P<0.01）。小鼠體內(nèi)針對(duì)綿羊紅細(xì)胞刺激產(chǎn)生的溶血素水平顯著提升，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 EPS對(duì)小鼠HC50及吞噬細(xì)胞吞噬功能的影響()Table 3 Effect of EPS from strain PH0016 on HC50and phagocytic function

表3 EPS對(duì)小鼠HC50及吞噬細(xì)胞吞噬功能的影響()Table 3 Effect of EPS from strain PH0016 on HC50and phagocytic function

注：*與正常對(duì)照組比較，P<0.01。

2.5 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能

菌株P(guān)H0016胞外多糖連續(xù)灌胃后，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬效率達(dá)到（52.38±4.28）%，吞噬指數(shù)為1.56±0.17，相比于正常對(duì)照的吞噬效率18.76±5.10和吞噬指數(shù)0.50±0.19有顯著升高（P<0.01），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 3。

2.6 菌株P(guān)H0016分類(lèi)鑒定

2.6.1 菌株P(guān)H0016的形態(tài)學(xué)特征

接種于查氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，7 d直徑可達(dá)15 mm～18 mm。菌落扁平、質(zhì)地疏松、粉絮狀、淡紫色。表面紫色為產(chǎn)孢層，產(chǎn)孢旺盛，肉眼可見(jiàn)紫色孢子密集。菌落邊緣質(zhì)地疏松，呈白色，菌落背面呈白色。PDA培養(yǎng)基形態(tài)同查氏培養(yǎng)基。沙氏培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)速度緩慢，灰白色，中央隆起，質(zhì)地較疏松，不形成紫色色素。光鏡下?tīng)I(yíng)養(yǎng)菌絲壁光滑，無(wú)色透明。分生孢子梗光滑無(wú)色，單個(gè)小梗直立于營(yíng)養(yǎng)菌絲上，瓶梗基部膨大，孢梗上有2～4個(gè)瓶梗狀的輪生分枝。頂部錐形變細(xì)，形成較薄獨(dú)特的頸，分生孢子成向兩側(cè)分開(kāi)的鏈狀，偶有糾纏，分生孢子呈卵形或近球形，成熟后表面粗糙，透明無(wú)色，成團(tuán)時(shí)呈紫色。

2.6.2 ITS序列分析結(jié)果

測(cè)序獲得菌株P(guān)H0016ITS序列長(zhǎng)度為588 bp。將該序列與Genbank相關(guān)序列進(jìn)行BLAST相似性分析，選取與其同源性較高菌株，用Neighbour Joining method構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）。結(jié)果顯示，PH0016與一株未明確命名的真菌菌株（FJ612890，F(xiàn)ungal sp.ARIZ L99）聚為一支，兩者相似率達(dá)到100%，其Bootsrap支持率為100%；其分類(lèi)地位為子囊菌綱（Ascomycetes）；肉座菌目（Hypocreales）；麥角菌科（Clavicipitaceae）；擬青霉屬（Paecilomyces）。

圖1 基于ITS序列的菌株P(guān)H0016與相關(guān)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Dendrogram of rDNA ITS sequence of PH0016

3 討論

課題組在海南東寨紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)土壤樣本中分離得到真菌536株，其中菌株P(guān)H0016經(jīng)初步形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育鑒定為淡紫色擬青霉菌株。該菌株所產(chǎn)生的胞外多糖在體外具有較好的刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖效應(yīng)。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株所產(chǎn)生的胞外多糖連續(xù)灌胃小鼠后，對(duì)于小鼠臟體指數(shù)、血清溶血素生成水平、遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)應(yīng)答能力及小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能均有較為顯著的增強(qiáng)效應(yīng)。這些指標(biāo)的提升說(shuō)明，淡紫色擬青霉菌株P(guān)H0016所產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)小鼠特異性和非特異性免疫應(yīng)答均有一定的增強(qiáng)效果。綜合上述分析，課題組從海南近海紅樹(shù)林地區(qū)分離獲得一株產(chǎn)免疫增強(qiáng)效應(yīng)胞外多糖的淡紫色擬青霉菌株。

糖單體之間有多種不同的連接方式，可形成不同構(gòu)型的直鏈和支鏈結(jié)構(gòu)。通過(guò)單糖分子間氫鍵及基團(tuán)的相互作用進(jìn)一步又可進(jìn)一步形成不同的高級(jí)結(jié)構(gòu)，3個(gè)單糖最多可以有27648種可能的排列方式，寡糖鏈多變的連接方式和分支結(jié)構(gòu)使多糖承載了巨大的生物信息[8-9]。

課題組從海南紅樹(shù)林分離獲得一株淡紫色擬青霉，初步證實(shí)其胞外多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，這可能與真菌為適應(yīng)特殊生存環(huán)境而產(chǎn)生獨(dú)特代謝機(jī)制和新穎代謝產(chǎn)物有關(guān)。

本研究獲得真菌菌株存在于海南紅樹(shù)林底泥之中，對(duì)近海環(huán)境有較好的適應(yīng)性。對(duì)該菌株生物學(xué)性狀及代謝途徑的進(jìn)一步研究，以及對(duì)菌株所產(chǎn)生EPS的組份與結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步分析，將可能為當(dāng)?shù)啬壳叭找鏀U(kuò)大的近海水產(chǎn)養(yǎng)殖及保健食品開(kāi)發(fā)提供理論研究參考。

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