響應面法優化蒸餾型牛奶酒發酵工藝

馬榮山，王清，邢艷芳

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110161）

奶酒是以乳及乳制品為原料，經酵母菌和乳酸菌發酵制成的飲料酒，按制作工藝可分為發酵型奶酒和蒸餾型奶酒[1]。發酵型奶酒風味獨特，營養豐富，有良好的保健作用[2-4]，但常溫下無法久貯，因而逐漸演化產生了蒸餾型奶酒。蒸餾型奶酒是由乳清經發酵后蒸餾制成的，是蒙古族獨具民族特色的乳飲料，其酒體清亮透明，有純正、清雅、和諧的乳香與酒香，微酸爽口，含有多種維生素和氨基酸，有特殊的保健功能和輔助治療作用[5-6]。蒸餾奶酒雜醇油和甲醇含量也特別低，是一種既營養又衛生的低度酒[7]。

目前，人們對酒的需求逐漸向營養化、功能化轉變，奶酒會被越來越多的人重視。本研究以牛乳為主要原料，通過新的發酵工藝提高蒸餾奶酒的質量并使其更符合大眾的口味，有較大的市場價值及發展前景。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

鮮牛乳、白砂糖：市售；

酵母菌：安琪牌葡萄酒高活性干酵母；乳酸球菌：沈陽農業大學食品學院釀造實驗室保藏；

檸檬酸、酒石酸鉀、氫氧化鈉、硫酸銅、亞鐵氰化鉀等試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設備

HH-6恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；HG330恒溫培養箱：南京實驗儀器廠；酒精比重計：河北省滄縣杜生熱工儀表廠；糖度計：沈陽市玻璃計四廠；全玻璃蒸餾器等。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 主要分析測定方法

酒精度測定：酒精計法；總酸測定：酸堿中和法；總酯測定：指示劑法[8]。

1.3.3 發酵技術要點

1.3.3.1 原料乳的驗收

選擇不含抗生素及防腐劑的新鮮牛乳為原料，按GB5409-1985《牛乳檢驗方法》執行。

1.3.3.2 巴氏滅菌

調制后的乳清加熱到65℃，保溫30 min，以殺滅有害微生物，確保發酵順利進行。

1.3.3.3 發酵劑的制備

酵母菌發酵劑：干酵母→10 mL 5%蔗糖溶液，28℃活化30 min→1 mL活化酵母菌→10 mL含8%蔗糖的乳清，培養48 h→1 mL酵母菌→100 mL含8%蔗糖的乳清，培養48 h→酵母菌發酵劑；

乳酸菌發酵劑：乳酸菌干粉→10 mL脫脂乳培養基，30℃培養48 h→1 mL乳酸菌液→100 mL脫脂乳培養基中，30℃培養48 h→乳酸菌發酵劑。

1.3.3.4 發酵

經調制滅菌的乳清液中依次接入定量的酵母菌和乳酸菌發酵劑，30℃下發酵培養7 d。發酵結束后，過濾除去蛋白質沉淀以及菌體等雜質，煎酒停止發酵。

1.3.3.5 蒸餾

發酵結束后，進入蒸餾階段。經2次蒸餾的奶酒酒精體積分數可以達到15%～25%。

1.4 試驗設計

1.4.1 單因素試驗

在酵母菌和乳酸菌接種比例為4∶1、30℃發酵7 d的條件下，選擇初始糖度、初始pH、接入乳酸菌時間、混合接種量進行單因素試驗，通過對成品酒的酒精體積分數、總酸含量、總酯含量以及感官評分的綜合評定，考察各因素對發酵的影響，感官評價標準見表1。

表1 感官評價標準Table 1 Criterion of sensory score for distilled milk wine

1.4.2 響應面法優化蒸餾型奶酒發酵工藝

在單因素試驗基礎上，根據Minitab 15軟件中響應面設計程序的Box-Behnken設計，以X1初始糖度、X2初始pH、X3接入乳酸菌時間、X4混合接種量為自變量（自變量編碼值1、0、－1分別代表自變量的高、中、低水平），Y酒精體積分數為響應值，對蒸餾型奶酒的發酵工藝進行優化，試驗因素和水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗因素及水平表Table 2 Variables and levels in Box-Behnken central composite design

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 初始糖度對發酵的影響

初始糖度對發酵的影響，見表3。

表3 初始糖度對成品酒質量的影響Table 3 Effect of initial sugar content on the quality of distilled milk wine

釀酒酵母屬于乳糖非發酵型酵母，不能利用乳清中的乳糖發酵產生乙醇，因此用蔗糖額外補充糖分。由表3可知，糖度過高或過低都會對發酵產生不良影響，調整發酵液的初始糖度為19°Bx時，成品酒的酒精體積分數最高，感官評價最好。

2.1.2 初始pH對發酵的影響

初始pH對發酵的影響，見表4。

表4 初始pH對成品酒質量的影響Table 4 Effect of initial pH value on the quality of distilled milk wine

酵母菌適宜在中性或微酸性的環境中生長，pH的變化會影響其生長和產物的合成。酸度高有利于抑制雜菌，但使成酒略帶澀味；酸度過低則易受微生物侵染，且成品寡淡，欠爽口[9-10]。從表4可以看出，調整乳清的初始pH到4.5時，成品的酒精度較高，各項指標較好，風味口感最佳。

2.1.3 接入乳酸菌時間對發酵的影響

接入乳酸菌時間對發酵的影響，見表5。奶酒的發酵是酒精和乳酸聯合發酵，酵母發酵產生的乙醇和乳酸菌發酵產生的乳酸作用生成乳酸乙酯，賦予奶酒獨特的風味。接入酵母菌之后，乳酸菌的接入時間不同會導致成品酒酒體有機酸組成和風味物質不同[11]。由表5可知，酵母菌和乳酸菌一起接入（0 h），成品酒質量較差，酒精體積分數也不高。在酵母單獨發酵24 h后接入乳酸菌可使菌種之間達到良好的協同作用，奶酒的酒精體積分數最高，感官評價最好。

表5 接入乳酸菌時間對成品酒質量的影響Table 5 Effect of the time that inoculate lactobacillus on the quality of distilled milk wine

2.1.4 混合接種量對發酵的影響

混合接種量對發酵的影響，見表6。

表6 混合接種量對成品酒質量的影響Table 6 Effect of inoculating amount of mix-fermentation on the quality of distilled milk wine

酵母菌和乳酸菌的混合接種量對成酒的品質有很大的影響。若酵母菌的接種量太少，則發酵時間延長，且產生的乙醇量較低；乳酸菌接種量過低會導致成品酸度降低、口味寡淡，且影響產品中乳酸乙酯的形成；如果酵母菌接種量太多，菌種生長過快、過密，會導致大量的酵母菌早衰和菌體自溶現象，產生苦味和酵母臭味，從而影響產品的品質；乳酸菌接種量太多，則會產生大量的乳酸，使產品酸度過高，影響成品酒風味[12-13]。從表6可知，混合接種量為8%時，成品酒精體積分數達到了20.6%，產品口味及香氣適宜。

2.2 響應面法優化蒸餾奶酒發酵工藝

2.2.1 模型的建立及方差分析

模型的建立及方差分析，見表7。

對表7的試驗數據進行回歸分析，得到二次多元回歸方程（模型）：

該模型進行方差分析結果見表8，模型系數顯著性檢驗見表9。

表7 Box-Behnken試驗設計及結果Table 7 Results of Box-Behnken central composite design

表8 回歸模型方差分析Table 8 Analysis of variance of the developed regression equation

從表8可以看出，該模型極顯著（P<0.01）；因變量與自變量之間的線性關系以及平方、交互作用極顯著（P<0.01）；失擬度不顯著（P>0.05），表明該方程對試驗擬合良好，可用此模型對響應值進行分析和預測。

由表9回歸系數顯著性檢驗結果可知，模型中接入乳酸菌時間、混合接種量對酒精體積分數的影響極顯著（各二次項P<0.01）；初始糖度對酒精體積分數的影響顯著（二次項P<0.05）；初始糖度與接入乳酸菌時間、初始糖度與混合接種量、初始pH與接入乳酸菌時間的交互作用顯著（P<0.05）；接入乳酸菌時間與混合接種量的交互作用極顯著（P<0.01）。

表9 回歸方程系數顯著性檢驗Table 9 The significant test of regression coefficients

2.2.2 響應面分析及優化

初始糖度和初始pH對酒精體積分數的影響，見圖1。

圖1 初始糖度和初始pH對酒精體積分數的影響Fig.1 Effect of initial sugar content and initial pH value on the alcoholicity

從圖1可以看出，隨著初始糖度的升高酒精體積分數先上升后下降，不受初始pH的交互作用的影響。初始糖度和接入乳酸菌時間對酒精體積分數的影響，見圖2。可以看出，初始糖度對酒精體積分數的影響受接入乳酸菌時間的交互作用的影響，較早接入乳酸菌時，酒精體積分數隨初始糖度的升高而降低；較晚接入乳酸菌時，初始糖度升高，酒精體積分數升高。

初始糖度和混合接種量對酒精體積分數的影響，見圖3。

圖2 初始糖度和接入乳酸菌時間對酒精體積分數的影響Fig.2 Effect of initial sugar content and the time that inoculate lactobacillus on the alcoholicity

圖3 初始糖度和混合接種量對酒精體積分數的影響Fig.3 Effect of initial sugar content and inoculating amount of mix-fermentation on the alcoholicity

由圖3可知，初始糖度對酒精體積分數的影響受混合菌種接種量交互作用的影響，混合菌種接種量較低時，酒精體積分數隨初始糖度升高而降低；混合菌種接種量較高時，初始糖度升高，酒精體積分數升高。

初始pH和接入乳酸菌時間對酒精體積分數的影響，見圖4。

圖4 初始pH和接入乳酸菌時間對酒精體積分數的影響Fig.4 Effect of initial pH value and the time that inoculate lactobacillus on the alcoholicity

由圖4可知，初始pH對酒精體積分數的影響受接入乳酸菌時間的交互作用的影響，較早接入乳酸菌時，酒精體積分數隨初始pH的升高而升高；較晚接入乳酸菌時，初始pH升高，酒精體積分數降低。

初始pH和混合接種量對酒精體積分數的影響，見圖5。

圖5 初始pH和混合接種量對酒精體積分數的影響Fig.5 Effect of initial pH value and inoculating amount of mix-fermentation on the alcoholicity

從圖5可以看出，隨初始pH的升高酒精體積分數先升高后下降，不受混合菌種接種量交互作用的影響。接入乳酸菌時間和混合接種量對酒精體積分數的影響，見圖6。

從圖6可以看出，接入乳酸菌時間對酒精體積分數的影響受混合菌種接種量的交互作用的影響。

圖6 接入乳酸菌時間和混合接種量對酒精體積分數的影響Fig.6 Effect of the time that inoculate lactobacillus and inoculating amount of mix-fermentation on the alcoholicity

2.2.3 工藝優化和驗證性試驗

由回歸方程確定的最優工藝條件為：初始糖度19.31 °Bx，初始pH4.41，酵母單獨發酵26.06 h后接入乳酸菌，混合接種量8.34%，在此條件下成品酒酒精體積分數的最大預測值為21.64%。考慮實際操作性，將發酵工藝參數修正為：初始糖度19.3°Bx，初始pH4.4，酵母菌單獨發酵26 h后接入乳酸菌，混合接種量8.3%。在此條件下進行驗證試驗，成品酒酒精體積分數為20.8%，符合率達96.12%，說明優化工藝的模型有效。

2.3 成品酒質量指標

2.3.1 感官指標

清亮透明；有純正、清雅、和諧的乳香和酒香；綿甜醇和，無異味；具有本品突出的風格。

2.3.2 理化指標

酒精度(體積分數)/%：15～20；總酸（以乙酸計）/（g/L）:0.3～0.6；總酯（以乙酸乙酯計）/（g/L）：0.6～0.8。

2.3.3 衛生指標

甲醇/（g/L）≤0.40；雜醇油/（g/L）≤1.50。

3 結論

采用響應面法優化蒸餾型牛奶酒發酵工藝，得出的優化工藝條件為：初始糖度19.3°Bx，初始pH4.4，酵母單獨發酵26 h后接入乳酸菌，混合接種量8.3%。在此條件下，產品的酒精體積分數為20.8%。試驗建立的二次回歸模型對試驗擬合較好。所得的成酒奶香酒香濃郁，是一種營養豐富的保健酒，開發前景廣闊。

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