硝苯地平生物黏附微球的制備及釋藥機制研究

周曉東，于立軍（南京軍區南京總醫院湯山分院藥械科，南京211131）

難溶性藥物經胃腸道給藥面臨的難題在于如何提高其生物利用度，通過改善難溶性藥物從制劑中溶出的速度和藥物的溶解度，進而提高生物利用度，已成為藥學工作者研究和關注的焦點[1，2]。生物黏附給藥系統（Bioadhesive drug deliverysysterms，BDDS）是利用載藥材料對生物黏膜表面的黏附性能，使給藥系統在生物膜的特定部位滯留時間延長，或達到藥物在特定部位吸收的目的[3，4]。微球（Microsphere）是指藥物溶解或分散在載藥材料基質中形成粒徑為1～40 μm的微小球狀實體，是近年來制劑研究的新熱點[5，6]。本文以難溶性藥物硝苯地平（Nifedipine，NFP）為模型藥物，利用BDDS技術制備NFP生物黏附微球，考察其體外黏附性能和釋藥行為，并對其釋藥機制進行研究，探討制備難溶性藥物生物黏附微球的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ALC-210.4分析天平（德國Sartorius公司）；752紫外分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；ZRS-8 G型智能藥物溶出儀（天津天大天發儀器有限公司）；恒溫水浴箱（常州國華電器有限公司）。

1.2 材料

乙基纖維素水分散體（商品名：Surelease?，上海卡樂康包衣技術有限公司）；卡波姆934（簡稱CP，北京佳福晨康藥用輔料有限公司）；NFP原料藥（武漢遠城國際集團，批號：20100901，純度：99.6%）；NFP對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100338，純度：99.5%）；聚乙烯醇（PVA，上海強順化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

透析袋（天長市康鴻塑業有限公司，截留分子量：1000）。

2 方法與結果

2.1 NFP生物黏附微球的制備

取處方量的NFP溶于適量丙酮溶液中，混合均勻，磁力攪拌下將上述溶液加入分散介質司盤80中分散，攪拌1～2h。依次加入適量戊二醛（交聯劑）和硫酸（固化劑），使之交聯成球。減壓抽去溶劑，依次用丙酮和水各洗滌3遍，取微球置于干燥器中干燥過夜。收集制得的微球，用Surelease?和CP混合液包黏附衣層，包衣溫度60℃，包衣干燥時間4 h，包衣增重15%，干燥后貯存，即可得到NFP生物黏附微球；同法制備不含包衣層的微球。

2.2 NFP含量測定方法學考察

精密稱取干燥至恒重的NFP 30 mg，用少許甲醇溶解后再以乙醇定容至100 mL，作為貯備液。精密吸取貯備液1、2、3、4、5、6mL置于50mL棕色量瓶中，以0.5%十二烷基硫酸鈉（SDS）水溶液定容至刻度，制備成硝苯地平濃度分別為6、12、18、24、30、36 μg·mL－1的系列標準溶液；以0.5%SDS水溶液為空白，在333 nm波長下測定吸光度。以濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標，進行線性回歸處理，得回歸方程為y＝0.0115 x+0.0015（r＝0.9993），結果，NFP檢測濃度線性范圍為6～36 μg·mL－1。分別進行低、中、高濃度（10、20、30 μg·mL－1）的回收率試驗和精密度試驗，結果低、中、高濃度的平均回收率為99.5%（RSD＝1.8%），日內RSD分別為2.3%、1.5%、2.2%，日間RSD分別為2.4%、1.8%、2.0%，表明方法的準確度和精密度均符合要求。

2.3 正交試驗設計優化生物黏附微球處方工藝

在前期單因素考察的基礎上，設計制備微球，總處方量為5mL，分別對影響微球質量的因素進行考察：加熱溫度（A，℃）、PVA用量（B，g）、司盤濃度（C，%）、戊二醛用量（D，mL）。每個因素選取3個水平，選用L9（34）正交設計表，以藥物24 h累積釋藥率為評價指標，優化微球處方。L9（34）正交試驗設計因素和水平見表1，正交試驗結果見表2，方差分析見表3。

表1 因素和水平Tab 1 Factor and levels

表2 正交試驗結果Tab 2 Design and results of orthogonal design

表3 方差分析結果Tab 3 Result of variance analysis

由直觀分析可知，各因素對藥物釋放的影響大小順序為因素C＞D＞B＞A。通過方差分析可知，D因素的變化有統計學差異，故優選D2，而A、B、C因素的變化無統計學差異，綜合考慮，確定處方優選結果為D2A2B2C2，即加熱溫度為60℃，PVA用量為0.6 g，司盤濃度為5%，戊二醛用量為0.6 mL。以此制備3批樣品，進行質量考察。

2.4 微球的質量考察

2.4.1 載藥量、包封率的測定。取微球加入研缽中研磨，精密稱量50 mg，置于25 mL量瓶中，加入適量0.5%SDS溶液后，超聲溶解，定容，搖勻，靜置。濾過，取續濾液備用。精密量取續濾液1 mL置于100 mL量瓶中，加入0.5%SDS溶液稀釋至刻度，搖勻。取以相同方法制備的空白微球溶液和對照品溶液，于333 nm波長處測定吸光度。每批微球測定3次，由外標法計算藥物濃度，根據下列公式計算微球包封率和載藥量[7]：包封率（%）＝（微球中的含藥量/微球與介質中的總藥量）×100%，載藥量（%）＝（微球中NFP質量/微球總質量）×100%。結果平均載藥量約為15%，包封率約為85%，詳見表4。

表4 3批微球載藥量及包封率測定結果Tab 4 Results of drug-loading amount and encapsulation efficiency of 3batches of microspheres

2.4.2 微球粒徑的測定。取微球適量，分散于適量水中，超聲震蕩15 min后，均勻涂布于載玻片上，采用光學顯微觀察微球的粒徑及分布。根據公式D＝∑（nd）/∑n（D：平均粒徑；n：微球個數；d：統計范圍內微球等價粒徑的平均值）計算800個微球的粒徑得平均粒徑，再根據800個微球粒徑的統計結果，分析微球粒徑的分布范圍[7]，結果見圖1。

圖1 微球粒徑分布圖Fig 1 The particle size distribution of microspheres

從圖1可見，本法制備的微球平均粒徑約為20μm，其粒徑85%均勻分布在16～20μm左右，可知粒徑分布均勻。

2.4.3 體外黏附性能的評價。采用自制的體外黏附力測定裝置[8]。試驗時用502膠水將適量生物黏附微球的一側固定于2 cm×2 cm背面帶掛鉤的聚氯乙烯薄片B上，備用；將已準備的大鼠胃組織剪成小片，用502膠水固定于相同規格的薄片A上。滴加生理鹽水5滴于微球表面潤濕10 min后與固定于薄片A的胃組織接觸，并給予500 g壓力，施壓時間5 min，將薄片A掛鉤垂直固定，在薄片B掛鉤上掛系一塑料袋，以8～10 mL·min－1的速度向袋中注水，直至微球下側與黏膜分離，記錄塑料袋、水及薄片B的重量（g），即得體外最大黏附力。測定3批微球的最大體外黏附力并與未包衣的微球比較，結果見表5。

表5 2種微球體外黏附力測定結果Tab 5 The adhesive ability of 2kinds of microspheres in vitro

由表5可知，黏附微球體外黏附力明顯高于未包衣微球，前者具有較好的黏附效果。

2.4.4 體外釋放性考察。以900 mL 0.5%SDS溶液為釋放介質，保持溫度在（37±1）℃。精密稱取適量微球，置于透析袋中，將透析袋放入釋放杯中，開啟攪拌（100 r·min－1）。分別于0、1、2、4、8、12、14、18、24 h取樣5 mL（同時在溶出杯中補入相同體積的新鮮釋放介質）。濾過，精密量取續濾液1 mL，置于25 mL量瓶中，加入0.5%SDS溶液至刻度，搖勻。取相同方法制備的空白微球溶液和對照品溶液，于333 nm波長處測定吸光度。按外標法計算各點的藥物濃度，求算3批微球的累積釋藥率，繪制體外釋藥曲線，見圖2。

圖2 微球的體外釋藥曲線（n＝3）Fig 2 Drug release curves of microspheres in vitro（n＝3）

由圖2可見，微球可持續24 h釋藥；體外釋藥曲線分別按零級、一級、Higuchi方程擬合，結果顯示所制微球數據符合Higuchi釋藥動力學方程（r＞0.9900），具有較好的體外緩釋性能。

2.5 釋藥機制研究

根據藥物從骨架中釋放機制的Ritger-Peppas方程[9]可知：Mt/M∞＝ktn。式中：Mt/M∞為藥物在某一時間的累積釋藥率；t為釋放時間；k為常數，該常數隨不同藥物或不同處方以及不同釋放條件而變化，表示釋放速率大小的重要參數；n為釋放參數，為Ritger-Peppas方程中表示釋放機制的特征參數（當n＜0.45時，服從Fick擴散；當n＞0.89時，為骨架溶蝕機制；當0.45＜n＜0.89時，為非Fick擴散機制，藥物釋放機制為混合型，即藥物釋放為藥物的擴散和骨架溶蝕雙重機制[9]）。

結果，Ritger-Peppas擬合方程為：lnQ＝0.7512 t+2.0821（r＝0.9978），其中n＝0.7512（0.45＜n＜0.85），為非Fick擴散機制，表明NFP從自制黏附微球中以擴散和骨架溶蝕2種途徑釋放。

3 討論

本試驗中采用乙基纖維素水分散體Surelease?和CP混合作為外層黏附衣層，一方面可以通過Surelease?適當的膜孔有效調節NFP的釋放行為，另一方面可以借助CP的黏附性能使微球較長時間地黏附于胃腸黏膜[10]，增加藥物吸收，以期提高難溶性藥物的生物利用度。

生物黏附微球的制備過程中可變因素較多，本文在單因素考察的基礎上通過正交設計優化處方工藝，分別考察了加熱溫度等各因素對微球釋藥的影響，最終以優選處方工藝連續制備3批樣品并評價其質量。結果顯示所制微球具有緩釋性，其釋藥機制符合非Fick擴散機制，藥物以溶蝕和擴散2種模式釋放。

本研究建立的體外黏附力的測定可在一定程度上反映制劑體內的黏附性能，但準確度仍需進一步探明。同時，NFP生物黏附微球體內釋藥行為及體內吸收的相關性等仍有待于進一步研究。

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