黃芪提取液對(duì)大腸桿菌抑菌特性研究

毛森軍，霍健聰

（浙江海洋學(xué)院普陀科技學(xué)院，浙江 舟山 316000）

大腸桿菌是引起食物中毒的主要微生物之一，是食品微生物必檢指標(biāo)。據(jù)舟山市水產(chǎn)品加工出口協(xié)會(huì)有關(guān)數(shù)據(jù)顯示：舟山市每年出口水產(chǎn)品中由于大腸桿菌超標(biāo)而造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百萬(wàn)美元。目前使用防腐劑仍是解決包括大腸桿菌在內(nèi)的食品微生物超標(biāo)的主要手段之一，但因苯甲酸（鈉）等化學(xué)防腐劑食品安全性不斷受到質(zhì)疑，歐盟等國(guó)家和地區(qū)對(duì)化學(xué)防腐劑的使用和檢測(cè)越來(lái)越嚴(yán)格，開(kāi)發(fā)新型食品防腐劑成為必然。天然防腐劑由于其安全性高不斷受到關(guān)注，更成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。近20年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于天然防腐劑的研究主要集中于植物多糖、香辛料（植物源）或抗菌肽（動(dòng)物源）等，但是動(dòng)物源生物防腐劑普遍存在提取條件苛刻、提取成本高、抗菌譜窄、帶有異味、價(jià)格偏高等缺陷，導(dǎo)致其實(shí)際應(yīng)用極為有限[1-3]。結(jié)合我國(guó)擁有豐富的植物資源這一得天獨(dú)厚的條件，開(kāi)發(fā)生物天然防腐劑成為今后防腐劑發(fā)展的主要方向。

黃芪（Astragalus mongholicus）又稱黃耆，是我國(guó)傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根[4]。《中國(guó)藥典》中記載：黃芪有益氣固表、斂汗固脫、托瘡生肌、利水消腫之功效，有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗應(yīng)激、降壓和較廣泛的抗菌作用。本研究旨在通過(guò)對(duì)黃芪提取液抑菌效果研究和抑菌特性研究，開(kāi)發(fā)天然防腐劑，為黃芪開(kāi)辟綜合利用新途徑。

1 材料與方法

1.1 供實(shí)菌種

大腸桿菌（Escherichia coli）：購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；黃芪：購(gòu)于舟山市存德堂大藥房；培養(yǎng)基制備：稱取牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂20.0 g，水1000 mL，加熱融化后調(diào)節(jié)pH到7.4～7.6，分裝后在121℃條件下滅菌20 min，備用（液體培養(yǎng)基不加瓊脂）。

1.2 黃芪提取液原液的制備

參考蔣益虹等方法，做適量改進(jìn)[5]。取適量黃芪，切碎后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)，加入20倍質(zhì)量的水，減壓后保持微沸狀態(tài)下浸提、濃縮，得到黃芪提取液原液，即1 mL提取液中含有1 g黃芪。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌液的制備

將保藏菌種的安瓿瓶用75%醫(yī)用酒精擦拭后在火焰上加熱數(shù)秒鐘，用滅菌滴灌吸取無(wú)菌去離子水滴加至安瓿瓶頸部，使其炸裂，用無(wú)菌移液管吸取0.5 mL適宜的液體培養(yǎng)基滴入安瓿瓶?jī)?nèi)，振蕩將懸浮菌液注入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃下培養(yǎng)24 h，作為種子菌懸液。二次活化的實(shí)驗(yàn)菌種斜面培養(yǎng)24 h后，挑取一單菌落接種到100 mL液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，以無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋，同時(shí)記錄每一濃度梯度菌懸液吸光值OD，根據(jù)OD值和菌懸液濃度關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將菌懸液濃度調(diào)整為107cfu/mL左右。

1.4 抑菌效果實(shí)驗(yàn)[6]

1.4.1 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定

將黃芪提取液用培養(yǎng)基稀釋成梯度濃度，每個(gè)濃度重復(fù)2次，同時(shí)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。在含有不同濃度提取液的培養(yǎng)基中加入0.1 mL菌懸液，混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算，并按下式計(jì)算抑菌率。

抑菌率/%=（對(duì)照實(shí)驗(yàn)菌落數(shù)-相應(yīng)濃度培養(yǎng)基菌落數(shù)）×100%/對(duì)照實(shí)驗(yàn)菌落數(shù)

1.4.2 pH對(duì)黃芪提取液抑菌活性的影響

采用0.5%NaOH和1%HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基酸度，設(shè)置 5、6、7、8、9 共 5 個(gè)梯度，加入低于 MIC 一個(gè)數(shù)量級(jí)濃度的提取液，再加入0.1 mL菌懸液，以無(wú)菌水作為對(duì)照，培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。

1.4.3 溫度對(duì)黃芪提取液抑菌活性的影響

取低于MIC一個(gè)數(shù)量級(jí)濃度的黃芪提取液分別置于 60、80、100℃水浴和 121℃條件下處理 20、15、10、5 min，然后立刻取出置于冰箱中冷卻，加入0.1 mL濃度為107cfu/mL的菌懸液，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 h后平板計(jì)數(shù)，探討溫度對(duì)黃芪提取液抑菌活性的影響。以無(wú)菌水作用對(duì)照。

1.4.4 金屬離子對(duì)黃芪提取液抑菌活性的影響

分別選用食品中常見(jiàn)的NaCl和CaCl2配成0.1mol/L和0.05 mol/L培養(yǎng)基溶液，加入低于MIC一個(gè)數(shù)量級(jí)濃度的提取液，加入0.1 mL濃度為107cfu/mL的菌懸液，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 h后平板計(jì)數(shù)并計(jì)算抑菌率，以無(wú)菌水做對(duì)照，探討金屬離子對(duì)黃芪提取液抑菌活性的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃芪提取液最低抑菌濃度MIC

表1 不同濃度黃芪提取液的抑菌率Table 1 Antibacterial rate of different concentration of Astragalus mongholicus

從表1可以看出，黃芪提取液對(duì)大腸桿菌具有較強(qiáng)的抑菌效果。隨著抑菌濃度的增加，抑菌率顯著提高，其中當(dāng)提取液濃度稀釋6次后，濃度比1∶64，即提取液濃度為1.563 mg/mL時(shí)抑菌率僅為8.90%，而提取液濃度為6.25 mg/mL時(shí)抑菌率高達(dá)72.44%，高于該濃度提取液抑菌率達(dá)100%。這表明黃芪提取液最低抑菌濃度MIC為12.5 mg/mL，表明黃芪提取液在較低濃度下有較強(qiáng)的抑菌活性。

2.2 pH對(duì)黃芪提取液抑菌活性的影響

圖1是不同pH對(duì)黃芪提取液抑菌活性的影響。

圖1 不同pH對(duì)黃芪提取液抑菌活性的影響Fig.1 Effect of pH of Astragalus mongholicusn extract

從圖1中可以看出，不同pH對(duì)黃芪提取液抑菌活性影響較大，酸性條件下提取液抑菌活性較高，均達(dá)到85%以上；而中性及堿性條件下黃芪提取液抑菌活性顯著降低，pH越高則抑菌活性越低。這表明黃芪提取液在酸性條件下對(duì)大腸桿菌抑菌活性顯著高于堿性條件。這可能是由于黃芪提取液中含有多種具有抑菌活性的有機(jī)酸，因而在堿性條件下抑菌活性較弱。黃芪的有機(jī)酸主要有香草酸、阿魏酸、異阿魏酸、對(duì)羥苯基丙烯酸、咖啡酸、綠原酸及棕櫚酸[7]。黃芪抑菌主要依賴自身有機(jī)酸創(chuàng)造的酸性條件實(shí)現(xiàn)，創(chuàng)造pH低于4的環(huán)境，使得大多數(shù)致病菌難以存活。黃芪總酸度僅是抑菌作用的一方面，可能還與其他化學(xué)成分有關(guān)，如黃酮類、胡蘿卜苷（daucostero1）、葉酸（folicacid）、β-谷甾醇（β-sitostero1）等。

2.3 溫度對(duì)黃芪提取液抑菌活性的影響

溫度對(duì)黃芪提取液抑菌活性的影響見(jiàn)圖2。

從圖2可以看出，黃芪提取液在不同溫度條件下處理不同時(shí)間后仍就有較強(qiáng)的抑菌活性，其中提取液經(jīng)100℃和121℃處理后，抑菌率有所降低，但仍然達(dá)到85%以上；而隨著處理溫度的下降，抑菌率明顯上升，其中60℃處理抑菌率為85.76%，只比空白實(shí)驗(yàn)低8個(gè)百分點(diǎn)。這表明黃芪提取液熱較為穩(wěn)定，具有較好的熱穩(wěn)定性。這為黃芪提取液在食品工業(yè)中的應(yīng)用奠定了良好的理化基礎(chǔ)，可將其應(yīng)用于巴氏殺菌的食品生產(chǎn)中。

圖2 不同溫度對(duì)提取液抑菌活性的影響Fig.2 Effect of temperature on antibacterial activity of Astragalus mongholicusn

2.4 金屬離子對(duì)黃芪提取液抑菌活性的影響

食品中大多含有鈉離子和鈣離子，為了探討黃芪提取液能否廣泛應(yīng)用在食品中，本文研究了其提取液在氯化鈉和氯化鈣體系中的抑菌活性，見(jiàn)圖3。

圖3 不同金屬離子對(duì)提取液抑菌活性的影響Fig.3 Effect of metal on antibacterial activity of Astragalus mongholicusn extract

由圖3可知，氯化鈉和氯化鈣對(duì)提取液抑菌活性影響差異較大，其中氯化鈉在所選取的兩個(gè)濃度條件下對(duì)提取液抑菌活性基本無(wú)影響，抑菌率均在90%左右；而氯化鈣對(duì)提取液抑菌活性影響顯著，同等濃度下抑菌活性顯著小于氯化鈉，且對(duì)抑菌活性的影響隨濃度增大而增強(qiáng)，在高濃度條件下抑菌活性僅為46.23%。這可能是由于鈣離子易與多種有機(jī)酸結(jié)合形成不溶性鈣鹽，如檸檬酸鈣、酒石酸鈣等，造成環(huán)境pH上升，抑菌活性降低。

2.5 室溫下放置時(shí)間對(duì)黃芪提取液抑菌活性的影響

前人研究資料顯示：在探討天然防腐劑抑菌效果時(shí)通常目的產(chǎn)物經(jīng)制備后直接測(cè)定其抑菌活性，而不探討環(huán)境對(duì)其抑菌活性的影響。到目前為止尚未見(jiàn)到天然防腐劑敞露于環(huán)境狀態(tài)下對(duì)其抑菌效果影響的研究，僅有藍(lán)江林從美洲大蠊中誘導(dǎo)、分離純化抗菌肽，經(jīng)室溫下暴露放置不同時(shí)間后檢測(cè)其抑菌活性發(fā)現(xiàn)，抗菌肽抑菌活性僅能維持3 d，5 d后僅有微弱抑菌活性，而抑菌活性于6 d后完全喪失[8]。由于前人對(duì)天然防腐劑的研究多集中于蛋白肽類或多糖類，而此類天然防腐劑防腐效果從長(zhǎng)時(shí)間看較差，時(shí)間長(zhǎng)后反而可促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，這也成為此類天然防腐劑應(yīng)用于食品工業(yè)的顯著弊端之一。

黃芪提取液室內(nèi)暴露與空氣中放置不同時(shí)間后抑菌效果見(jiàn)圖4。

圖4 放置時(shí)間對(duì)黃芪提取物液抑菌活性的影響Fig.4 Effect of laytime on antibacterial activity of Astragalus mongholicusn extract

從圖4中可以看出，放置時(shí)間對(duì)提取液抑菌活性影響極大，短時(shí)間放置對(duì)抑菌活性基本無(wú)影響，表現(xiàn)在放置2 d、4 d時(shí)，抑菌活性接近90%，而隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌活性顯著降低，放置8 d時(shí)，抑菌率僅為25%，抑菌活性基本消失殆盡。實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)放置8 d后提取液表面漂浮有菌落，表明提取液已被環(huán)境中的微生物污染，抑菌活性消失殆盡。這也提示黃芪提取液如要用于食品保藏，最好通過(guò)噴霧干燥等方式制成固體形式保存和應(yīng)用。

3 結(jié)論

開(kāi)發(fā)安全性高、防腐效果好的天然防腐劑已經(jīng)成為今后食品防腐劑的重要發(fā)展方向。黃芪是我國(guó)特產(chǎn)之一，具有多種生理功效。從本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，黃芪提取液具有良好的抑菌活性，其最低抑菌濃度為12.5 mg/mL，在酸性條件下提取液具有較高的抑菌活性，提取液對(duì)溫度較為穩(wěn)定，適用于采用巴氏殺菌的食品當(dāng)中，黃芪提取液對(duì)鈉離子適應(yīng)性好，而鈣離子可顯著降低其抑菌活性。綜上所述，黃芪提取液對(duì)大腸桿菌具有較好的抑制效果，可作為天然食品防腐劑應(yīng)用于食品當(dāng)中，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。

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