直接熒光過濾/平板計數法檢測輻照食品

張海濱，趙良娟，吳冬雪，張海英，張霞，劉培，鄭文杰

（天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津 300461）

食品輻照是20世紀發展起來的一種食品保藏技術。利用電離輻射對食品和其他農副產品進行加工處理，以達到控制食源性病原體，減少微生物污染和蟲害，抑制發芽和延長易腐農產品使用期的目的[1]。其具有冷加工處理、無二次污染和化學殘留、能耗低等優勢[2]。截至2005年，全世界輻照食品銷售總量已達到40.5萬t[3]。自從食品輻照技術出現以來，幾十年的動物毒理試驗的研究結果一致表明，食用輻照食品的動物生長、發育、遺傳與食用不輻照食品的動物完全相同，三致試驗（致畸、致癌、致突變）結果也沒有明顯變化，至今還沒有任何相反的報告。1980年，聯合國糧農組織（FAO）/世界衛生組織（WHO）/國際原子能機構（IAEA）組成的聯合專家委員會宣布，吸收劑量在10 kGy以下的任何輻照食品都是安全的，無需做毒理學試驗。1999年，FAO/IAEA/WHO高劑量輻照食品研究小組經過長期的研究工作，在報告中明確提出了超過10 kGy劑量的輻照食品也是衛生安全的。2003年，國際食品法典委員會（CAC）進一步規定允許在不對食品結構的完整性、功能特性和感官品質發生負面作用和不影響消費者的健康安全性的情況下，食品輻照的最大劑量可以高于10 kGy[4]。這些標準的通過在一定程度上減少了消費者對輻照食品安全的擔心，促進了輻照技術在食品包裝材料、糧食、水果等殺蟲、滅菌等領域的發展和應用。

CAC目前發布的輻照食品鑒定方法主要有3大類10個檢驗方法，主要有化學分析法、生物學分析法和物理分析法[5]。我國目前在食品輻照領域獲得了巨大的發展，但我國在輻照食品的質量監控與安全性規范方面還存在一些不足。自1994年起，我國先后頒布食品輻照處理的技術工藝標準及輻照標示管理的標準40余個，從技術工藝和標示上對輻照食品進行了規范，但是對于輻照食品鑒別技術的研究與國際標準的發展尚有差距。截至2011年，我國先后發布了2項國家標準、1項出入境檢驗檢疫行業標準及3項農業標準：GB/T 21926-2008《輻照含脂食品中2-十二烷基環丁酮測定氣相色譜/質譜法》、GB/T 23748-2009《輻照食品的鑒定DNA彗星試驗法篩選法》、SN/T 2522.1-2010《進出口輻照食品檢測方法微生物篩選法》、NY/T 1207-2006《輻照香辛料及脫水蔬菜熱釋光鑒定方法》、NY/T 1390-2007《輻照新鮮水果、蔬菜熱釋光鑒定方法》、NY/T 1573-2007《輻照含骨類動物源性食品的鑒定-ESR法》。

生物學分析方法中的直接熒光過濾技術/平板計數（DEFT/APC）方法是一種輻照食品鑒別初篩方法，具有操作簡便、硬件要求不高、高通量的優勢，同時能夠在鑒別檢測同時監測食品的微生物衛生狀況[6]。本文對該方法用于鑒定輻照香辛料及脫水蔬菜進行了研究。

1 分析方法

1.1 樣品

1.1.1 分析樣品

為保證樣品條件符合方法分析及驗證要求，樣品必須未經殺菌處理，故采樣環節盡量避免這些過程的混入，或經過篩選檢測需氧菌計數后選擇符合要求的樣品。根據我國批準范圍和產品特性，搜集了以下樣品：辣椒、黑胡椒、鼠尾草、姜、豆蔻、洋蔥、山茴香、花椒、姜黃、百里香、羅勒，脫水蘑菇、脫水青椒、脫水尖椒、脫水番茄、脫水胡籮卜，共計16種樣品，見表1，樣品購自北京及天津地區香辛料批發市場。

表1 輻照樣品及性狀Table 1 The names and properties of the irritated samples

1.1.2 分析樣品的制備

輻照劑量（吸收劑量）：分別為 4、5、10 kGy，同時以未輻照樣品作為對照，即0 kGy。輻照源采用60Co，將原始樣品充分混勻，每份取50 g樣品無菌分裝至無菌封口透明樹脂袋中，其外再以一透明樹脂袋包裝，作好標記，每個樣品種類按照10份平行試驗分裝。送至輻照中心按照指定劑量進行輻照處理。

1.2 方法

1.2.1 方法原理

本方法是將由直接落射熒光過濾檢測（DEFT）結果與平板計數法（APC）結果進行對比。APC方法檢測結果為輻照處理樣品中殘存活菌數，DEFT結果為樣品中活菌數及輻照處理后失活的細菌總數。將一定體積的樣液通過濾膜減壓過濾。以吖啶橙對截留在濾膜上的微生物進行熒光染色，在450 nm～490 nm藍光下產生橙色至橙黃色熒光，見圖1。

圖1 調味料直接落射熒光顯微鏡下發光特征Fig.1 The fluorescence character of spice samples under an epifluorescent microscope

APC及DEFT結果之間差值與特定閾值比較，判斷樣品是否經過輻照處理，如差值大于該閾值為陽性，反之則為陰性。

1.2.2 儀器及試驗器具

薄膜過濾器，抽濾瓶及抽濾漏斗，纖維素酯濾膜（孔徑 0.2 μm，直徑 47 mm），聚丙烯濾膜（孔徑 10 μm，直徑25 mm），白色聚碳酸脂濾膜（孔徑0.6 μm，直徑25 mm），無菌快速濾紙，落射熒光顯微鏡，載玻片和蓋玻片，其他微生物常規檢測設備及器具。

1.2.3 試劑及培養基

8.5 %生理鹽水，平板計數瓊脂，緩沖溶液（pH 3.0），吖啶橙染色液，2-丙醇，所有試劑使用前須進行無菌過濾，培養基應進行高壓滅菌。

1.2.4 檢測步驟

1.2.4.1 樣品過濾

取5 g試樣置于盛有45 mL滅菌蛋白胨鹽水稀釋液的錐形瓶中，劇烈搖動錐形瓶約30 s。將樣液通過無菌快速濾紙過濾。倍比稀釋后進行DEFT檢測及APC檢測。以預熱至80℃過濾除菌的1%Triton X-100過濾清洗薄膜過濾器3次，再用沸水清洗過濾塔3次。將0.6 μm聚碳酸酯膜光面朝上放置在薄膜過濾器中然后在其上放置10 μm孔徑的聚丙烯濾膜。將2 mL樣液經過濾器過濾。在真空泵運行狀態下將放置在白色聚碳酸酯膜上的10 μm孔徑的聚丙烯濾膜移去。取2 mL無菌生理鹽水按照上述操作進行作為空白對照。過濾不同樣品前須用沸水過濾清洗濾筒三次。

1.2.4.2 染色和制備DEFT玻片

關閉真空泵，在濾塔內加入2.5 mL吖啶橙溶液，2 min后開啟真空泵吸去吖啶橙溶液。保持連接真空泵運行并迅速用2.5 mL pH3.0緩沖液清洗濾膜。最后用2.5 mL 2-丙醇快速過濾清洗濾膜。關閉真空泵，用鑷子將聚碳酸酯膜夾起晾干。在載玻片中心滴一滴浸鏡油，將濾膜光面朝上放置在油滴中心。在濾膜中心再滴一滴浸鏡油。將蓋玻片放置于上方，輕輕地向下擠壓蓋玻片減少油層厚度。

1.2.4.3 平板計數（APC）

過濾和稀釋樣品后15 min內按照GB4789.2《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》進行APC檢測。在無菌培養皿中加入1 mL適當稀釋度的樣液然后加入大約15 mL平板計數瓊脂 [預先冷卻至（47±2）℃]混勻。待瓊脂凝固后將其倒置于（30±1）℃的培養箱內培養72 h。

1.2.4.4 DEFT計數

將DEFT片放入落射熒光顯微鏡下觀察，對可見的DEFT單位進行計數，在蓋玻片上滴一滴浸鏡油，置于熒光顯微鏡下，用100×oil物鏡觀察，在隨機選擇的顯微視野下，計數發黃色和橙黃色熒光的微生物DEFT計數單位。

1.2.4.5 計算結果

計算DEFT數，見公式（1）和（2）

式中：x為每克樣品中DEFT單位數；N為DEFT單位的總和；n為計數的顯微視野數；M為顯微鏡系數；D為樣品稀釋因子 （例如5 g樣品＋45 mL蛋白胨鹽水稀釋液=10 mL/g）；F為有效過濾面積，mm2，可測量過濾塔底部的直徑（r1=半徑）計算得出；A為顯微視野面積，mm2，可使用鏡臺測微計（最大量程0.01 mm）測量顯微視野的直徑（r2=半徑）計算得出；V為樣品體積，mL；每克香料中的DEFT數及其對數形式保留2位有效數字。

計算APC。依據GB 4789.2《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 菌落總數測定》的計算方法，培養后的培養皿可進行需氧微生物計數（APC計數）。依據樣液體積和稀釋因子對每克樣品中所含的微生物計數，數值可用菌落形成單位（cfu）來表述。APC數保留2位有效數字，轉成對數后也保留2位有效數字。

計算DEFT與APC差值。DEFT數和APC數分別取對數，求得差值（Dc）。見公式（3）。

式中：A為取log10換算后的DEFT值；B為取log10換算后的APC值。

2 檢測結果

按照步驟1中試驗方法，A～P樣品共計16種樣品基質檢測后，計算Dc值結果。以箱線圖形式表示，見圖2。

所有4組樣品即0、4、5、10 kGy輻照劑量下Dc平均值之間差異顯著（P<0.001）。0 kGy輻照劑量下Dc平均值最大值3.0，最小值1.3，單次檢測數據最大3.1，最小0.5。4 kGy輻照劑量下Dc平均值最大值5.1，最小值3.1，單次檢測數據最大5.5，最小2.5。5 kGy輻照劑量下Dc平均值最大值5.7，最小值3.6，單次檢測數據最大6.5，最小3.1。10 kGy輻照劑量下Dc平均值最大值7.5，最小值5.6，單次檢測數據最大8.4，最小5.2。每種樣品均呈現隨著輻照劑量升高，Dc值亦增加的趨勢。未經輻照即0 kGy樣品Dc值為0.5～3.1，閾值低于3.0可能導致假陽性判讀增加；當Dc大于等于3.0時，樣品至少經過5.0 kGy以上劑量輻照處理。所以，以3.0為判定閾值，可檢測出全部5 kGy輻照處理樣品，此時的假陽性率為3.1%。當以4.0為判定閾值時，則會有部分假陰性結果。作為初篩方法，假陰性結果會導致漏檢，應避免或使其降至最低。因此，對于本研究中的16種樣品設定判定閾值為3.0，可對5.0 kGy及5.0 kGy以上劑量處理的樣品進行初篩鑒定。

3 討論

圖2 0、4、5、10 kGy 輻照樣品檢測結果Fig.2 The testing results of samples irradiated under the dose of 0，4，5，10 kGy

鑒定輻照食品的微生物學初篩方法的靈敏度、適用性及可靠性主要受以下因素影響：樣品處理過程對計數結果的影響，計數判讀的準確性，樣品本身抑菌特性，樣品初始含菌量及菌群構成。樣品中含有的雜質、油滴和破碎細胞均可能對DEFT計數造成不利影響，在樣品前處理過程中采用兩步過濾法，即濾紙過濾及10 μm孔徑聚丙烯濾膜過濾，可有效去除雜質顆粒影響；對于游離疏水基團含量大的基質，可參考ISO6887的方法進行樣品前處理。DEFT檢測時熒光染色過程中應注意染色及脫色時間的控制；在熒光顯微鏡目視計數中，熒光照射時間不能過長或過短，一般以1 min為宜。有些樣品，如丁香、肉桂、大蒜和芥末具有一定的抑菌特性，在利用微生物學方法檢測時應注意出現假陽性。此外，如果樣品初始染菌量過低，如低于103cfu/g，會導致低于方法檢測限，也不適用本方法檢測[7]。各種微生物具有不同的輻照D10值，該值與輻照加工所需吸收劑量及微生物抗輻射力為正相關關系，香辛料及脫水蔬菜中一般分布的有芽孢桿菌、枯草桿菌、脂肪嗜熱桿菌、沙門氏菌、大腸菌群、霉菌及酵母菌等[8]，芽孢桿菌相對抗輻射能力較強，因此微生物的群落構成也會導致Dc值區間的變化及閾值的設定。Gun Wirtanen等研究中對于香辛料采用的閾值為3.5，能夠初篩鑒別5.0 kGy以上輻照處理樣品[6]。K.N.Oh等研究了韓國產胡椒粉等，采用閾值2.5能檢測3.0 kGy以上輻照樣品[9]。本文主要針對產自國內香辛料及脫水蔬菜樣品開展研究，所研究的16種樣品在閾值設定為3.0時，可初篩鑒別經5.0 kGy以上輻照樣品，且假陽性率較低，為3.1%。

4 結論

直接熒光濾膜/平板計數法初篩鑒定輻照食品的方法可用于我國調味料及脫水蔬菜的輻照鑒定，對于本文研究的11種香辛料及5種脫水蔬菜，設定閾值3.0可檢測經5.0 kGy以上輻照樣品。該方法除可應用于輻照調味料和脫水蔬菜的鑒定，還可以同時進行輻照產品衛生指標的監控，其具有操作簡便、硬件要求不高和實現多樣品同時檢測的特點，除了本文涉及的樣品基質種類，其他如乳制品、水產品、冷凍肉制品等也可應用本方法進行有效鑒別。

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