靈芝多糖清除自由基活性的研究

張志軍，李淑芳，魏雪生

（天津市林業果樹研究所，天津 300112）

靈芝（Ganoderma Lucidum）在我國自古就有“仙草”的美譽，已有悠久的藥用和食用歷史，如《神農本草經》、《本草綱目》中都有靈芝的藥效記載[1]。多糖是靈芝中具有生物活性的主要有效組分之一。20世紀70年代以來，靈芝多糖的研究開發進入了一個嶄新的發展時期，經過近30年的發展，人們對靈芝多糖這一類重要生命物質產生了新的認識[2]。據報道，從雙孢蘑菇、靈芝、香菇、側耳等6種真菌中提取出的活性成分，可以防止細胞內DNA的氧化損傷。劉志峰等的研究證明，蘑菇提取物對脂質過氧化的抑制率可達29%。真菌提取物對自由基有一定的清除作用[3]。真菌是自由基清除劑的良好載體。而多糖是真菌中的主要活性成分。

目前，國內外基本上采用水浸法、堿浸法提取多糖，再經有機溶劑沉淀提純。由于傳統工藝采用堿浸、有機溶劑分離提純等手段，易對靈芝多糖聚合體造成破壞；對某些活性基團也易造成變性失活，且粗多糖提取效率極低；膜分離技術是近年來發展起來的，在分子水平上實現機械分離的高新技術。由于它具有常溫操作，無相態變化，高效節能，在生產過程中不產生污染等特點，且整個分離過程在密閉系統中進行，可避免和減輕熱和氧對物料營養成分的影響，因此，膜分離技術被認為是21世紀最有前途的技術。因此，采用膜技術進行靈芝多糖的分離純化，不僅收率高而且極少破壞靈芝多糖結構[4]。

因此，本文對靈芝多糖的還原能力及其對羥自由基(·OH)和超氧自由基(·O2-)的清除活性進行了研究探討,并對不同工藝制取的靈芝多糖的清除自由基的能力進行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝：由天津市林業果樹研究所提供；

鄰苯三酚、番紅花T、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等均為分析純；

恒溫水浴箱：天津市泰斯特儀器有限公司；752分光光度計：上海第三分析儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 靈芝多糖制取方法

水提醇沉工藝：靈芝子實體→粉碎→粗濾→真空濃縮→醇沉→干燥

膜分離工藝：靈芝子實體→粉碎→預煮→粗濾→微濾→超濾→濃縮干燥

1.2.2 還原能力測定（鐵氰化鉀還原法）

在2.5 mL pH6.6磷酸緩沖溶液中加入1 mL提取物溶液，2.5 mL 1%鐵氰化鉀，混合物在50℃恒溫條件下，加熱20 min，急速冷卻，加2.5 mL 10%三氯乙酸，3000 r/min離心分離，取上層清液2.5 mL，加2.5 mL水再加0.5mL 0.1%FeCl3，混合均勻，靜置10 min后在波長700 nm下測吸光度A值。A700越大，則樣品的還原力越強。

1.2.4 對超氧陰離子·O2-的清除作用

根據吳慧平的方法，鄰苯三酚在堿性條件下能發生自氧化生成有色中間物（在420 nm處有最大吸收峰）和·O2-，·O2-對自氧化又起催化作用，依據有色中間物生成量的多少，可判斷·O2-生成量的多少。實驗體系為3 mL Tris-HCl緩沖液（pH8.2）和0.1 mL不同濃度的樣品，25℃水浴20 min后加入3 mL濃度為7 mmol/L的鄰苯三酚，反應4 min后加入10 mol/L的HCl終止反應，以Tris-HCl緩沖液作參比，在420 nm處測OD值。對照組以0.1 mL蒸餾水代替樣品，空白組以不加鄰苯三酚，根據清除率判斷樣品對·O2-生成的影響。

2 結果與討論

2.1 靈芝多糖的還原能力測定

還原力法的原理為：K3Fe(CN)6+樣品→K4Fe(CN)6+樣品氧化物

在波長700 nm條件下測定吸光度A，A越大，則樣品的還原能力越大。

靈芝多糖的抗氧化能力測定，見表1。可知0.10mg/mL多糖溶液的A700與水體系A700值相當，說明該濃度（均指加入反應體系的樣品起始濃度，后同）下靈芝多糖沒有還原能力。其后4個濃度，隨著濃度的增大，A700值也增大，多糖的還原能力在試驗濃度范圍內有較好的量效關系。以30μg/mLVC溶液的還原能力作參比，1.00 mg/mL多糖溶液的還原能力強于VC。以相同起始樣品濃度比較A700值，靈芝多糖還原能力明顯低于VC的還原能力，但多糖溶液還原能力的存在說明多糖具有表現抗氧化作用的可能性。

表1 靈芝多糖的抗氧化能力測定Table 1 The determinatiing test of antioxidant activity of Ganoderma Lucidum polysaccharide

2.2 靈芝多糖的清除自由基實驗

自由基產生過量可以引起生物膜和DNA的氧化性損傷,導致癌癥、動脈硬化、衰老和多種老年慢性疾病,如使用生物抗氧化劑切斷過氧化鏈式反應可以抑制機體的自由基損傷,從而保持最佳健康狀態和防治這些疾病,延緩衰老。

多糖可以捕捉脂質過氧化鏈式反應中產生的活性氧,減少脂質過氧化反應鏈的長度，阻斷或減緩脂質過氧化的進行。對于·OH而言，可快速地攫取多糖碳氫鏈上的氫原子結合成水，而多糖的碳原子上則留下一個成單電子，成為碳自由基，進一步氧化形成過氧自由基，最后分解成對機體無害的產物；對于·O2-，多糖可與其發生氧化反應,達到清除的目的。

2.2.1 不同提取工藝對·OH的清除作用

不同提取工藝對·OH的清除作用見表2。

表2 不同多糖提取工藝對羥自由基（·OH）的清除作用Table 2 Scavenging effect of Ganoderma Lucidum polysaccharide by different extraction technology on·OH

由表2可知，隨著多糖濃度的增加，對Fenton反應體系產生的羥基自由基的清除率增大，量效關系非常明顯。在相同濃度下，新工藝多糖清除羥自由基的能力強于傳統工藝，IC50分別為1.58、1.36。

2.2.2 不同提取工藝對·O2-的清除作用

不同提取工藝對·O2-的清除作用見表3。

表3 不同多糖提取工藝對超氧陰離子（·O2-）的清除作用Table 3 Scavenging effect of Ganoderma Lucidum polysaccharide by different extraction technology on·O2-

由表3可知，隨著多糖濃度的增加，對鄰苯三酚自氧化體系產生的超氧陰離子自由基的清除率增大，且量效關系非常明顯。在相同濃度下，新工藝多糖清除超氧陰離子的能力強于傳統工藝，IC50分別為2.83、2.55。

以上實驗數據均表明，新工藝制取的靈芝多糖的清除自由基的能力強于傳統工藝，這是因為，在靈芝多糖的制取過程中，傳統工藝采用了有機溶劑和多次高溫處理，使多糖的生物活性受到影響的緣故。

3 結論

1）靈芝多糖濃度在0.1 mg/mL時，A700與水體系相當，基本沒有還原能力；在1.0 mg/mL時，多糖溶液的還原能力強于30 ug/mL的VC溶液；由多糖溶液的還原能力的存在說明多糖具有抗氧化作用的可能性。

2）對不同制取工藝的靈芝多糖的清除自由基能力進行比較，結果表明，膜分離工藝制取的靈芝多糖清除超氧陰離子·O2-和羥自由基·OH的能力均較好，并且清除能力和多糖的濃度存在明顯的量效關系。

[1]馬禮金.靈芝的藥用及食用研究[J].食品與發酵工業,2000，24(1)：62-66

[2]藺麗，方能虎，吳旦，等.靈芝的主要生物活性研究概況[J].中國食用菌，2000，21(3)：38-40

[3]肖建輝，將儂輝，梁宗琪,等.食藥用真菌多糖研究進展[J].生命的化學，2002，22（2）：148-151

[4]劉建華，張志軍.靈芝多糖提取與應用現狀[J].保鮮與加工，2003，3（3）：9-10