3－MST mRNA在大鼠延髓的表達以及急性缺氧對其基因表達的影響

聶政，李慧，侯雪飛，周華，唐玉紅，陳麗，鄭煜

（四川大學華西基礎醫學與法醫學院生理學教研室，四川 成都 610041）

硫化氫（H2S）是近年來研究較多的第3種氣體信號分子，在機體內廣泛參與神經［1］、心血管［2］、消化［3］等系統的生理功能調節。外源性H2S可直接由含硫化合物（如NaHS）水解而成，而內源性H2S由含硫氨基酸（如半胱氨酸）代謝生成，體內參與催化H2S生成的酶主要有3種，即胱硫醚－β－合酶（cystathionine－β－synthase，CBS），胱硫醚－γ－裂解酶（cystathionine－γ－lyase，CSE）［4，5］和3－巰基丙酮酸硫轉 移 酶 （3－mercaptopyruvate sulfurtransferase，3－MST）［6，7］，CBS、CSE及3－MST 的表達具有組織特異性：CBS和3－MST主要存在于中樞神經系統［8］，CSE主要分布在神經系統以外的組織［9］，3－MST是腦內產生H2S的主要合成酶［7］。本室前期研究表明，內源性H2S參與延髓呼吸中樞節律性呼吸活動的調節并對呼吸中樞缺氧損傷具有保護作用［10，11］，然而，成年大鼠延髓是否存在3－MST、3－MST－H2S途徑，是否參與急性缺氧大鼠延髓呼吸中樞缺氧損傷保護作用以及在節律性呼吸活動調節中的作用尚未見報道，因此，本實驗對正常、急性缺氧以及急性缺氧加NaHS（外源性H2S供體）處理后成年大鼠延髓的3－MST mRNA表達進行了研究。1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年SD大鼠21只，雌雄不限，體質量為250～300g，由四川大學華西實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為正常對照組（C組）、急性缺氧組（H組）和急性缺氧＋NaHS組（HN組）。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol總 RNA 提取試劑，Invitrogen，USA；2×PCR master mix，Fermentas，USA；逆轉錄試劑盒，Fermentas，USA；其他試劑均為國產分析純；PCR儀，德國Eppendorf公司；電泳儀，美國BIORad公司；立體定位儀，成都泰盟科技有限公司。

1.3 急性缺氧模型的建立和側腦室給藥

大鼠在10%烏拉坦（13mL／kg體重）腹腔給藥麻醉后，行氣管插管及側腦室鉆孔手術，以備側腦室給藥。側腦室定位：前囟（bregma）后1.0mm，中線旁開1.5mm，深度為顱骨表面下4.0mm。C組動物經氣管插管一端開口吸入流量為1 000mL／min的空氣（氣管插管的另一端開口夾閉），其側腦室注入10μl 0.9%生理鹽水，注射時間30s，H組以同樣流量吸入8%O2＋92%N2低氧混合氣體，持續1 h，側腦室也注入10μl 0.9%生理鹽水，注射時間30 s。而HN組側腦室注入2.5mmol／L的NaHS 10 μl，其他處理同H組。

1.4 大鼠延髓總RNA的制備

取大鼠延髓組織，用Trizol總RNA試劑盒提取組織總RNA。將取延髓組織放于研磨缽內，加入適量液氮充分研磨，直至組織成為均勻粉末狀，加入1mL Trizol液勻漿研碎組織，加0.2mL氯仿，振蕩混勻，室溫放置2～3min，12 000rpm離心15 min（4℃），轉移水相，加0.5mL異丙醇沉淀RNA，室溫放置10min，同上離心，棄上清，用75%乙醇漂洗RNA，7500rpm離心5min（4℃），干燥后用適量DEPC水溶解。用紫外分光光度計測定總RNA濃度和純度，重復測定3次，留取OD260和OD280之比1.8～2.0的樣本進行逆轉錄。

1.5 逆轉錄反應

取1μg總RNA置于70℃孵育5min后依次加入反轉錄緩沖液、dNTP、Randon Primer、MMuLV反轉錄酶，42℃反應60min后70℃加熱10 min終止反應。

1.6 RT－PCR檢測

采用引物設計軟件primer premier 5.0設計引物，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。3－MST的上游引物為5＇－TCATCAAGACCCACGAGGATA－3＇，下游引物為5＇－CTTCTCCAGACCTTCACTGGTC－3＇內 參 βactin的上游引物為5＇－TCAGGTCATCACTATCGGCAAT－3＇，下游引物為5＇－AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA－3＇。采用生工生物工程（上海）有限公司的Revert AidTMFrist Strand cDNA Synthesis Kit，按照說明書進行PCR擴增。擴增反應體系為20μl的混合物（包括TaqDNA聚合酶、cDNA、上游及下游引物、dNTPs、MgCl2、Buffer），將所得進行3－MST及β－actin的擴增，建立25μl擴增反應體系，擴增按照35個循環進行，最后將所得產物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳完成后，將瓊脂糖凝膠板置于凝膠成像系統下觀察，保存圖形。用Quantity One軟件測定各條帶的吸光度值，用同一樣本3－MST與β－actin條帶吸光度值之比表示3－MST mRNA的相對表達量。

1.7 統計學處理

統計學分析數據以均數±標準差表示，用SPSS 15.0軟件進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結果

RT－PCR結果顯示，C組大鼠延髓組織擴增出3－MST mRNA 的特異性條帶（圖1），說明3－MST mRNA在正常成年大鼠延髓組織中有表達；H組大鼠延髓3－MST mRNA表達高于C組（圖1A），差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1B）。HN組大鼠延髓3－MST mRNA表達低于H組（圖1A），差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1B）。

圖1 正常組、急性缺氧組和急性缺氧＋NaHS組大鼠延髓3－MST mRNA的表達

3 討論

缺氧能引發多系統病變，若機體長時間處于缺氧狀態，則會對細胞造成嚴重損傷。有研究表明，組織缺氧或缺血期間，其抗氧化酶活性降低，氧自由基和脂質過氧化產物增多，而未被清除的氧自由基會通過對線粒體膜的損害、呼吸鏈的干擾而導致細胞的損害［12］。呼吸中樞廣泛分布于脊髓、延髓、腦橋和大腦皮層等整個中樞神經系統的各級部位，而基本的呼吸節律起源于延髓。延髓呼吸中樞在呼吸節律的產生及呼吸調節等活動中發揮著重要作用。

H2S被稱為繼NO和CO之后的第3種氣體信號分子，作為新型氣體信號分子的H2S，具有持續產生、快速彌散、迅速傳播等特點，在多系統的重要生理和病理過程中發揮著重要的調節作用［1，2］。H2S一般以結合型硫烷硫（bound sulfane sulfur）的形式儲存在神經元和星型膠質細胞內，當細胞興奮時，結合型硫烷硫釋放出H2S，與CBS相比，3－MST能更有效地催化生成結合型硫烷硫，因此，有研究者提出3－MST是重要的合成內源性H2S的酶，而且是腦內H2S的主要合成酶［7］。目前關于3－MST是否存在于延髓、3－MST－H2S途徑是否參與節律性呼吸活動的調節以及在急性缺氧條件下是否會參與由急性缺氧引起的呼吸反應和呼吸中樞的保護效應尚未見報道。已有研究表明，內源性H2S不僅參與對心血管系統的調節［2］、內分泌系統的調節［13，14］及呼吸系統功能活動的調節［10］，研究還發現H2S在鱒魚腮化學感受器中參與對缺氧的感受活動［15］，除此以外它還參與平滑肌細胞對缺氧的舒縮反應［16］。本室前期在新生大鼠離體延髓腦片灌流實驗中發現，由CBS催化產生內源性H2S參與了節律性呼吸活動的中樞性調節，而這一作用可能是通過激活KATP通道和cAMP信號通路實現的［10］，給予外源性H2S可減輕缺氧對延髓腦片呼吸中樞造成的損傷，表明H2S對延髓呼吸中樞缺氧損傷具有保護作用［11］，過量表達的CBS可以減輕缺氧誘導的細胞凋亡［17］。

既然由CBS催化產生的內源性H2S參與了節律性呼吸活動的中樞性調節，那么主要分布于神經元且催化效率較高的H2S合成酶3－MST是否存在于大鼠延髓？3MST－H2S途徑是否參與節律性呼吸的中樞性調節？該途徑是否參與急性缺氧大鼠延髓呼吸中樞缺氧損傷保護作用？為此，我們采用RTPCR方法，首先在基因轉錄水平，觀察了3－MST mRNA在正常大鼠、急性缺氧大鼠和急性缺氧＋NaHS大鼠延髓的表達情況。結果顯示，在正常大鼠延髓，擴增出3－MST基因特異條帶，說明延髓存在產生內源性H2S的另一個關鍵酶3－MST。該結果提示，3－MST－H2S途徑可能參與節律性呼吸的中樞性調節；與正常組相比，急性缺氧組大鼠延髓3－MST mRNA的表達明顯增加，提示急性缺氧可以上調3－MST mRNA的表達。該表達上調可能通過后續催化內源性H2S生成，從而對急性呼吸中樞缺氧損傷起到保護作用；而側腦室注射外源性H2S供體NaHS后大鼠延髓3－MST mRNA的表達明顯低于急性缺氧組，由于H2S一般以結合型硫烷硫的形式存在，當細胞興奮時，結合型硫烷硫釋放出H2S。當加入外源性H2S后，組織中升高的H2S濃度可能反過來抑制體內結合型硫烷硫釋放出H2S，導致內源性H2S生成減少，3－MST mRNA的表達因而減少，這也提示3－MST－H2S途徑可能參與急性缺氧大鼠延髓呼吸中樞缺氧損傷保護作用及節律性呼吸的中樞性調節作用。

4 結論

正常大鼠延髓組織存在產生H2S的另一個關鍵酶3－MST，急性缺氧能上調大鼠延髓3－MST mRNA的表達，外源性H2S能抑制急性缺氧大鼠3－MST mRNA的表達。

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