干細胞因子SOX2調控Wnt／β－Catenin信號通路在腦膠質母細胞瘤發生中的機制研究

吳偉，李鵬，薛平

（1.成都市第一人民醫院神經外科，四川 成都 610016；2.四川大學華西醫院中西醫結合科，四川 成都 610041）

腦膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是成人中樞神經系統最常見的原發腫瘤，由于該病具有很強的侵襲能力，生長迅速，患者死亡率及復發率較高，預后差。隨著腫瘤干細胞的發現與深入研究，腫瘤干細胞理論隨之產生［1］，GBM的治療得到了有效改善。研究表明，經典Wnt信號通路參與胚胎發育的各個階段，它的異常激活可導致腫瘤的形成。Wnt信號通路能夠使β－catenin蛋白激活特定的靶基因，因此β－catenin是該傳導通路的調節中心［2］。GBM是與Wnt信號系統激活密切相關的腫瘤，不同級別GBM大都伴有 Wnt信號激活［3］。SOX2作為全能型或多能性干細胞標記物，是維持干細胞未分化狀態、增殖等方面的關鍵因子之一，在人類許多腫瘤中SOX基因均呈異常表達。本研究通過檢測腦膠質母細胞瘤（GBM）組織中干細胞因子SOX2及β－Catenin蛋白的表達，探討 SOX2及 Wnt／β－Catenin信號通路在GBM中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

雄性SD大鼠90只，體質量（200～250）g，由武漢大學動物實驗中心提供。

1.1.2 主要試劑及儀器

大鼠神經膠質瘤細胞C6購自上海豐翔生物公司；小鼠抗人SOX2多克隆抗體購自北京博奧森生物技術公司；β－catenin抗體購自上海萬安生物技術有限公司；小鼠超敏二步法免疫組化試劑盒（PV－9005）購自北京欣興唐生物科技有限公司；新生小牛血清、DMEM 培養基、D－Hanks＇液、B27添加劑、重組人表皮生長因子（EGF）、重組人堿性成纖維生長因子（FGF）、Fc段封閉抗體均購自武漢子心生物科技有限公司。桌面型數字腦立體定位儀68025購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。Gyroscan T5－NT 0.5T磁共振機由Philips醫療器械公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

將C6細胞置入含10%新生小牛血清的DMEM培養基、5%CO2，37℃飽和濕度培養箱中培養。

1.2.2 動物造模

取70只SD大鼠固定于立體定向儀上，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，切開頭皮，暴露顱骨標志，在矢狀縫右旁開3mm，前后囪中點前1mm處用牙鉆鉆一骨孔。靜脈注射套管針抽取50μl C6細胞懸液，經骨孔垂直于顱骨外板向腦尾狀核注射，最后縫合頭皮，同時肌注青霉素1萬U。術后3周對大鼠行磁共振掃描，篩選成瘤細胞大鼠65只。

1.2.3 GBM干細胞的分化、鑒定及原代培養

模型大鼠處死取腦部腫瘤組織，PBS反復沖洗，去除壞死組織。將腫瘤組織剪切為0.5mm組織塊，制成單細胞懸液，篩網過濾，PBS沖洗離心，DMEM＋F12培養液（按1：50添加B27；EGF及FGF的終濃度為20ng／ml）重懸細胞，并調整細胞濃度至1×105個／ml后，置于培養瓶內傳代培養。

1.2.4 實驗分組

將剩余20只正常大鼠處死，取其腦組織按上述方法培養作為對照組，原代培養的GBM干細胞重懸于100μl培養基作為實驗組。

1.2.5 免疫組化法檢測SOX2及β－catenin的表達

分別取上述單細胞懸液涂片，100%冷丙酮4℃固定5min，依次加入SOX2一抗（稀釋度為1：100）及β－catenin一抗（稀釋度為1：1600），采用免疫組織化學SP法檢測，步驟按試劑盒說明書操作。用已知的陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為空白對照，正常腦組織作為陰性對照。

1.2.6 結果判定

以細胞膜或／和胞漿出現棕黃色顆粒即定為陽性，無棕黃色顆粒為陰性。隨機選擇5個以上高倍視野（×400），每張切片選取具有代表性的腫瘤區域在鏡下計數100個腫瘤細胞，測定陽性細胞百分率，排除壞死區和血管內皮細胞。

1.2.7 統計學方法

以SPSS 13.0軟件包分析數據，組間比較采用χ2檢驗，采用Spearman相關分析分析目標蛋白的相關關系，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SOX2、β－catenin蛋白在 GBM 干細胞及正常腦組織中的免疫組化染色

SOX2蛋白在GBM干細胞中呈陽性表達，主要表達于細胞核，正常腦組織中未見陽性表達。βcatenin蛋白在GBM干細胞細胞核也可見大量陽性染色細胞，正常腦組織陽性染色細胞少見，見圖1。

2.2 SOX2及β－catenin蛋白在GBM干細胞及正常腦組織中的表達

SOX2及β－catenin蛋白在GBM干細胞組織中的陽性表達強度分別為56.92%和43.08%，明顯高于正常腦組織的0和15.0%，見表1。

表1 SOX2及β－catenin在GBM干細胞及正常腦組織中的表達

2.3 SOX2及β－catenin蛋白在肺癌干細胞表達的相關性

SOX2及β－catenin蛋白在肺癌干細胞表達的呈正相關，r＝0.372，P＜0.05。

3 討論

隨著干細胞研究的深入，多種腫瘤組織如腦膠質瘤、卵巢癌、胃癌等中的腫瘤干細胞已被成功分離鑒定，這些干細胞是腦膠質瘤的“種子”細胞，具有自我更新、增殖和多向分化潛能等干細胞屬性［4］。

表2 SOX2與β－catenin蛋白表達的相關性

隨著分子生物學在腫瘤發展中的應用，越來越多的基因和信號通路被證明與膠質瘤的形成有關。Wnt／β－Catenin通路是腫瘤生成過程中重要的通路之一，且與多個通路聯系密切，β－Catenin是該通路中重要的轉錄因子，在腫瘤的生物學行為調控中起重要作用。Wnt／β－Catenin通路在各種腫瘤中呈現異常激活狀態，有文獻報道，惡性膠質瘤中β－Catenin的高表達影響著包括細胞增殖、侵襲、凋亡等各種惡性表型在內的生物學行為［5］。Porath等［6］通過基因芯片方法發現干細胞樣基因的高表達是低分化腫瘤的分子機制。SOX2是Wnt信號通路的調控因子，作為干細胞基因，能夠通過與其靶基因結合的方式調控胚胎及組織的發育，在乳腺癌、胰腺癌、肺癌等多種腫瘤組織中均有表達。

通過圖1～2我們發現，SOX2及β－Catenin蛋白在GBM干細胞中均有大量陽性染色細胞，而正常腦細胞中無SOX2陽性染色細胞，也僅有少量β－Catenin陽性表達細胞。另外，表1顯示，GBM干細胞中SOX2蛋白陽性表達率為56.92%，正常腦組織中未見SOX2表達，二者之間有顯著差異性（χ2＝3.836，P＜0.05），提示干細胞基因SOX2在 GBM的發生過程中可能發揮了重要作用。同時，β－Catenin在GBM干細胞中陽性表達率為43.08%，顯著高于正常腦組織的陽性表達率（15.0%），組間比較差異顯著（χ2＝3.652，P＜0.05），提示 β－Catenin在GBM干細胞中呈高表達，也證實了當發生GBM時，Wnt／β－Catenin信號通路處于異常激活狀態，與文獻報道一致。從表2中我們看出，在GBM干細胞中，SOX2與β－Catenin均呈高表達，二者的表達呈正相關（χ2＝0.372，P＜0.05），由此我們推測，在肺癌GBM干細胞中，高表達的SOX2基因，通過調控 Wnt／β－Catenin信號通路使其異常激活，共同參與了GBM的發生。

綜上所述，干細胞因子SOX2可能通過調控Wnt／β－Catenin信號通路，在GBM的發生發展過程中發揮重要作用，為針對GBM干細胞治療該病提供了新靶點。

［1］Takebe N，Ivy SP.Controversies in cancer stem cells：targeting embryonic signaling pathways［J］.Clin Cancer Res，2010，16（12）：3106－3112.

［2］成夏炫，史麗云，張航，等.Wnt信號通路與腫瘤藥物治療研究進展［J］.健康研究，2011，31（6）：460－465.

［3］王海東，杜天明，項永生，等.Wnt信號調控因子Pygo2在人腦膠質瘤中的表達及意義［J］.中華神經外科疾病研究雜志，2010，9（6）：513－516.

［4］Takaishi S，Okumura T，Tu S，et al.Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44［J］.Stem Cells，2009，27（5）：1006－1020.

［5］Sanada Y，Yoshida K，Ohara M，et al.Histopathologic evaluation of stepwise progression of pancreatic carcinoma with immunohistochemical analysis of gastric epithelial transcription factor SOX2：comparison of expression patterns between invasive components and cancerous or nonneoplastic intraductal components［J］.Pancreas，2006，32（2）：164－170.

［6］趙慶生，冷飛燕，鄭偉，等.干細胞因子SOX2在肺癌中的表達及意義［J］.山東醫藥，2011，51（28）：12－14.