腫瘤壞死因子－α對人表皮黑素細胞增殖及黑素合成的影響研究

林新瑜，王芳，林鴻剛，段西凌

（1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院皮膚病性病研究所，四川 成都 610072；2.四川大學國家生物治療重點實驗室，四川 成都 610041）

黃褐斑、白癜風等是臨床上常見的色素障礙性疾病，目前其發病機理還不十分清楚，治療難度也較大，影響美觀。黑素細胞合成黑素是在其特征性細胞器－黑素小體內進行的，酪氨酸酶是黑素生成的主要限速酶。本研究建立正常人表皮黑素細胞體外培養體系，采用不同濃度的腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）作用于體外培養的黑素細胞，觀察其對黑素細胞生物活性的影響，包括黑素細胞的增殖、黑素合成和黑素細胞的凋亡率，從而為研究色素障礙性皮膚病的發病機制及色素性疾病的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器

MCDB－153培養基，牛胰島素，人轉鐵蛋白，LDopa，TNF－α，DMSO，MTT 均購自美國 Sigma公司。重組人表皮生長因子（rhEGF）購于美國Peprotech公司，牛垂體提取物（BPE）購于美國Invitrogen公司。10%新生小牛血清購自Hyclone公司。EDTA－Na2購自美國Gibco公司。氫化可的松0.5μg／ml，青霉素100IU／ml，鏈霉素100 IU／ml，胰蛋白酶，苔盼蘭均系國產。培養瓶、96孔板和6孔板均購于美國Corning公司；酶聯免疫檢測儀；流式細胞儀。標本經患者知情同意后取自18～35歲行包皮環切術的正常人包皮。

1.2 方法

1.2.1 正常人黑素細胞的培養及鑒定

參照文獻［1～4］進行黑素細胞體外純培養，培養細胞經多巴染色、Fontana銀染、S－100蛋白免疫組化染色進行鑒定［5］，證實其為黑素細胞。

1.2.2 黑素細胞增殖的測定

采用四甲基偶氮唑藍比色法（MTT法）［6］，按公式計算其凈抑制率。抑制率＝（對照組－實驗組）／對照組×100%，凈抑制率＝各組的抑制率－溶劑對照組（PBS）的抑制率。

1.2.3 黑素合成的測定

采用 NAOH 法［7］。黑素合成抑制率＝［1－（藥物孔吸光度值÷藥物孔細胞密度）÷（對照孔吸光度值÷對照孔細胞密度）］×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測

細胞培養、計數等如前，按2×105／孔接種到6孔板，濃度100ng／ml的TNF－α處理組和PBS對照組，空白對照組設置如前，細胞處理72h后，分別收集細胞懸液轉到相應的已經收集有各自上清的離心管里，1500rpm離心3min，棄去上清，重復3次PBS清洗過程后，棄去上清，加入PI溶液，室溫避光孵育30min，上機檢測。

1.3 統計學處理

全部數據采用SPSS統計軟件10.0版進行分析。

2 結果

2.1 形態學結果

體外培養的正常人黑素細胞為雙極、三極和多極的樹突狀細胞，細胞增殖良好，細胞樹突之間交織成網（見圖1）。

2.2 黑素細胞鑒定

2.2.1 L－Dopa 染 色

第3代黑素細胞經0.1%L－Dopa染色后鏡下見黑素細胞胞質及樹突均被染成灰黑色（見圖2）。

2.2.2 Fontana銀染

3代黑素細胞經氨銀液避光浸染30min，細胞被染成黑色（見圖3）。

2.2.3 S－100蛋白染色

黑素細胞胞質及樹突呈棕黃色陽性著色從而可以鑒定為黑素細胞（見圖4）。

2.3 不同濃度TNF－α對人正常皮膚黑素細胞增殖率（%）的影響

黑素細胞增殖的測定結果見表1和表2。

表1 不同濃度TNF－α與PBS作用于黑素細胞后的抑制率的比較

表1可見，不同濃度TNF－α實驗組對黑素細胞的抑制率較PBS對照組相比有統計學意義（P＜0.05＃或P＜0.01＊）。

表2 不同濃度TNF－α作用于黑素細胞后的凈抑制率比較

從表2中可以看出隨作用時間增加，黑素細胞凈抑制率逐漸增加，而且隨TNF－α的濃度增加，黑素細胞的凈抑制率也逐漸增加，說明其對黑素細胞的抑制作用呈現出時間和劑量的相關性。

2.4 黑素合成的測定結果

表3 TNF－α作用于黑素細胞后的黑素合成抑制率的比較

從表3可見，405nm處和450nm處測量吸光度值，按公式計算其黑素合成抑制率均可見TNF－α作用后黑素合成抑制率增加，而且TNF－α組與PBS組比較，統計學上均有顯著性差異（P＜0.05＃）。

2.5 流式細胞術檢測結果

濃度為100ng／ml的TNF－α作用于黑素細胞72h后用流式細胞術檢測的結果：空白對照組黑素細胞凋亡率為4.0%，溶劑PBS組黑素細胞凋亡率為6.7%，TNF－α（100ng／ml）組黑素細胞凋亡率為35.4%。TNF－α（100ng／ml）組黑素細胞凋亡率與空白對照組及溶劑PBS組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。

3 討論

皮膚黑素化過程包括黑素細胞增殖、酪氨酸酶合成和活化以及黑素體的轉運和降解。酪氨酸酶是皮膚黑素生物合成的主要限速酶。黑素的合成受細胞因子、金屬離子、激素等多種因素的調節。黑素細胞的培養在皮膚色素性疾病的研究和治療中具有重要意義。TNF是一種主要由單核巨噬細胞分泌的細胞因子，影響多種組織和細胞的生長、分化，在免疫應答和炎癥反應的不同水平起著重要的調節作用。根據細胞來源和分子結構的不同，TNF可分為TNF－α和TNF－β型。TNF－α即經典的 TNF，主要由細菌脂多糖（LPS）激活的單核巨噬細胞產生。TNF－β即以往的淋巴毒素（lymphotoxin），主要由活化的T細胞產生。TNF－α正常儲存于真皮肥大細胞之中［8］，但激活的表皮朗格漢斯細胞［9］，甚至受到刺激的表皮角質形成細胞也可合成并釋放TNF－α［10］。黑素合成與細胞因子間的相互作用已引起學者們的關注。隋連金等學者［11］采用ELISA法測定了白癜風患者血清TNF－α水平，并與正常對照組相比較，結果發現白癜風患者血清T NF－α水平增高，提示其可能參與白癜風發病，并與白癜風的活動有關。曾靜等學者［12］采用SABC免疫組化法對18例進展期及20例穩定期白癜風患者皮損處TNF－α及其受體TNFR1進行檢測，并以20例正常人作對照，結果發現尋常型進展期白癜風皮損中TNF－α的表達較尋常型穩定期組顯著增加，尋常型穩定期白癜風皮損中TNF－α的表達較正常對照組顯著增加，患者組與對照組TNFR1無顯著性差異，提示TNF－α可能參與尋常型白癜風發病的某一環節。Swope［13］等研究發現IL－1、IL－6及 TNF－α3種細胞因子可抑制培養黑素細胞的酪氨酸酶活性，此外它們還能抑制黑素細胞的生長但無細胞毒性作用，故認為它們可能是阻礙黑素細胞黑素生成的重要因素。本研究建立正常人表皮黑素細胞體外培養體系后，用不同濃度的TNF－α作用于黑素細胞后也發現TNF－α對黑素細胞活力有抑制作用，能使細胞增殖力降低，兩者存在明顯的濃度和時間效應，濃度越高，抑制率越強，時間越長，抑制率越強，與Swope等［13］的研究一致。本研究還發現TNF－α作為旁分泌的細胞因子，還可導致黑素合成減少，增加黑素細胞的凋亡率。但是TNF－α是通過什么通路和機制達到這些作用還有待進一步的深入研究。

［1］丁國斌，陳璧，湯朝武.不同培養條件及時相對黑素細胞生物學特性的影響［J］.中國臨床康復，2002，6（24）：3665－3666.

［2］唐建兵.黑素細胞的體外培養研究進展及意義［J］.中國美容醫學，2010，19（8）：1244－1246.

［3］Tsuji T，Karasek M.A procedure for the isolation of primary culture of melanocyte from newborn and adult human skin［J］.J Invest Dermatol，1983，81（2）：179－180.

［4］項蕾紅，鄭志忠，祝綠川，等.黑素細胞體外純培養及生物學特性鑒定［J］.臨床皮膚科雜志，2001，30（3）：166－167.

［5］陳菊萍，冉玉平，魏大鵬，等.人黑素細胞培養最佳條件的選擇和生物學鑒定［J］.中國麻風皮膚病雜志，2007，23（3）：214－216.

［6］Mosmann T.Rapid colorimetric assay for celluar growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays［J］.J Immunol Methods，1983，65（1－2）：55－63.

［7］Boyd MR，Bacon TH，Sutton D，et al .Antiherpesvirus activity of 9－（4－Hydroxy－3－Hydroxy－methylbut－1－yl）guanine（BRL 39123）in cell culture［J］.Antimicrob Agents Chemother，1987，31（8）：1238－1242.

［8］Gordon JR，Galli SJ.Mast Cells as a source of both preformed and immunologicelly inducible TNF－alpha／cachectin ［J］.Nature，1990，346（6281）：274－276.

［9］Larrick JW，Morhenn V，Chiang YL，et al.Activated langerhans cells release tumor necrosis factor［J］.J Leukoc Biol，1989，45（5）：429－433.

［10］Kock A，Schwarz T，Kirnbaucr R，et al.Human keratinocytes are a source for tumor necrosis factor alpha：evidence for synthesis and release upon stimulation with endotoxin or ultraviolet light［J］.J Exp Med，1990，172（6）：1609－1614.

［11］隋連金，戎麗娟，王煒，等.白癜風患者血清相關細胞因子的檢測［J］.中國麻風皮膚病雜志，2006，22（5）：386－388.

［12］曾靜，張啟國，方春紅，等.腫瘤壞死因子－α及其受體在白癜風患者皮損中的表達［J］.中國皮膚性病學雜志，2006，20（7）：409－410，415.

［13］Swope VB，Abdel－Malek Z，Kssem LM，et al.Interleubins 1 alpha and 6and tumor necrosis factor－alpha are paracrine inhibitors of human melanocyte proliferation and melanogenesis［J］.J Invest Dermatol，1991，96（2）：180－185.