食管癌中MT－3基因mRNA的表達與含量差異性分析

李勇強，王智

（西安醫學院第二附屬醫院，陜西 西安 710038）

近年來，雖然腫瘤治療已經取得較大進展，但食管癌的預后仍然很差，5年生存率僅10%～20%。當前食管癌發病機制并未完全了解，初步研究表明食管癌的發生是多種癌基因的激活與抑癌基因的失活長期協同作用的結果［1］。金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是廣泛存在于人和哺乳動物體內的一類低分子量、富含半胱氨酸的小分子金屬結合蛋白，合成于肝臟，具有參與貯存、運輸和代謝微量金屬元素、重金屬解毒、抗輻射和清除自由基、抗衰老等多種重要生物學功能［2，3］。MT－3基因的異常表達與惡性腫瘤的發生和其惡性程度關系密切［4，5］。本文為此探討了食管癌中MT－3基因mRNA的表達與含量差異性，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用1∶1病例對照研究方法，研究對象選自2005年8月－2011年7月間我院食管癌手術就診者30例，其中男20例，女10例，年齡27～89歲，平均54.2歲，均為食管中段癌。國際TNM分期：ⅡA期18例，ⅡB期2例，Ⅲ期6例，Ⅳ期4例。組織學分級：高分化癌20例，中分化癌2例，低分化癌8例，組織類型均為鱗癌。同時取腫瘤中心及距腫瘤邊緣至少5cm的食管切緣組織，用液氮罐轉入－70℃冰箱凍存。

1.2 組織RNA的提取

勻漿處理：組織取50～100mg組織加入1mL TRIzol，用勻漿儀進行勻漿處理。將勻漿樣品在冰溫放置5min，按照1∶0.2的比例加入氯仿，渦旋振蕩15s，室溫放置3min。4℃12 000r／min離心15min。把水相轉移到新管中，用異丙醇沉淀水相中的RNA。加入25～200μl無RNase的水溶解RNA。

1.3 MT－3cDNA的PCR擴增

選擇MT－3的mRNA第84至300位長度為217bp的片段為擴增區域，NCBI庫中基因編碼為：NM005954，GI：5174761。 正向引物：5＇－GACCTGCCCCTGCCCTTCTGGTGG－3＇，反 向 引物：5＇－GCTCCACACGGAGGGGTGCCTTCT－3＇。反應體系：94℃5min，94℃45s，68℃45s，72℃30 s，共35個循環，72℃10min。

1.4 凝膠圖像分析

用熒光化學發光凝膠成像系統分析MT－3基因電泳結果。測定擴增產物量，PCR產物量以積分光密度（IOD）表示。IOD為電泳條帶平均光密度與電泳條帶面積的乘積。以與GAPDH條帶的IOD比值表示該組織中各MT－3基因mRNA的表達。

1.5 統計學方法

實驗數據采用SPSS 18.0軟件進行處理，表達情況對比采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MT－3在食管癌組織及切緣正常組織表達量統計學分析，即MT－3在食管癌組織中的表達量高于切緣正常組織（P＜0.01），見表1。

表1 MT－3在食管癌組織及切緣正常組織表達量對比（±s）

表1 MT－3在食管癌組織及切緣正常組織表達量對比（±s）

組別 樣本數（n）MT－3食管癌組織30 1.152±0.252切緣正常組織 30 0.893±0.189 t 4.285 P 0.000

2.2 經過統計分析，食管癌組織中MT－3的表達量與病理分期統計學分析差異有統計學意義（P＜0.01），分期越低其表達量越高。食管癌組織中MT－3的表達量與分化程度統計學分析差異有統計學意義（P＜0.01），分化程度越好其表達量越高，見表2。

3 討論

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發生和發展與一些癌基因及其產物的表達密切相關。研究發現，食管鱗狀細胞癌的腫瘤相關成纖維細胞能夠分泌WNT2促進腫瘤細胞生長，這種效應是通過激活 WNT2／beta－catenin通路發揮作用的。除環境因素以外，遺傳因素在食管癌的發生中也起到重要作用。研究團隊發現在食管鱗狀細胞癌患者中多數出現抑癌基因RBMS3的表達下調，深入研究發現，該基因可以下調c－Myc，進而影響Rb的磷酸化而發揮抑癌功能，該基因在患者腫瘤組織中的表達情況與患者的預后顯著相關［6］。

表2 MT－3在不同類型食管癌組織的表達量對比（±s）

表2 MT－3在不同類型食管癌組織的表達量對比（±s）

組別 樣本數（n）MT－3ⅡA期18 1.156±0.522ⅡB期 2 1.130±0.285Ⅲ期 6 0.954±0.119Ⅳ期 4 0.862±0.258 F 6.215 P 0.000高分化癌 20 0.962±0.126中分化癌 2 1.065±0.118低分化癌 8 1.163±0.145 F 7.251 P 0.000

MT－3最初發現它特異分布于中樞神經系統，是神經系統中第一個被鑒定出具有神經元生長抑制功能的蛋白［6］。近年來，MT－3的表達特點與多種腫瘤發生發展的關系逐漸引起了人們的關注。

金屬硫蛋白MT的重要生理功能表現在它是一種目前為人們所知的最有效的自由基清除劑，可起到抑制癌癥發生、防治腎病、消除炎癥和治療胃潰瘍等作用。不同發育階段有不同的表達模式，不受金屬離子等因素的誘導［7］。這些表達特征與MT－3基因的結構密切相關［8］。

近年來越來越多的資料顯示MT－3與腫瘤的關系密切，它參與了某些腫瘤的發生、發展，并且與腫瘤的分化程度有關，還與腫瘤細胞耐藥性有關，影響腫瘤的治療和預后。在除腦組織外的其他組織中MT－3首先在人類腎小管組織中發現有中到強度的表達，之后又發現在某些正常的前列腺上皮細胞中也有輕到中度的表達，在乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌和食管癌等中都有不同程度的表達。但MT－3在不同組織中表達所發揮致癌和抑癌作用并不相同［9］，有研究在2002年發現在前列腺癌細胞株中，存在MT－3過度表達的細胞生長受到明顯抑制［10］。

食管癌患者中MT存在多個基因位點的多態性，這可能影響到MT的解毒修復功能，與食管癌的易感性相關。有研究等分析了我國北方食管癌高發區70個食管癌組織標本的MT的遺傳多態性，發現7例和8個密碼子發生突變，其中6個產生氨基酸替換。這種替換可能改變酶的構象并削弱其活性，但在正常組織中并未發現［11］。本文結果顯示，MT－3在食管癌組織中的表達量高于正常組織。同時不同病理分期與分化程度的食管癌組織中MT－3的表達量存在差異，分期越低，分化程度越好，其表達量越高。

總之，食管癌中MT－3基因mRNA的表達與正常組織表達存在差異，同時其表達受到病理分化程度與分期的影響。

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