白骨壤種子中總黃酮的提取及抗氧化性研究

熊拯，鐘秋平，林美芳，唐媛園

（欽州學院海洋學院，廣西 欽州 535000）

白骨壤種子中總黃酮的提取及抗氧化性研究

熊拯，鐘秋平，林美芳，唐媛園

（欽州學院海洋學院，廣西 欽州 535000）

采用乙醇恒溫水浴法對白骨壤種子中總黃酮提取和L9（34）正交試驗設計進行優化，并采用Schaal烘箱法研究總黃酮的抗氧化性。結果表明，總黃酮最佳提取條件為料液比1:30（g/mL）、提取溫度60℃、提取時間4.5 h和乙醇濃度60%，且該條件下總黃酮提取率可達5.89%；白骨壤種子總黃酮對大豆油有一定的抗氧化效果，且具有量效關系；相同添加量下，抗氧化效果由強到弱的順序為0.02%TBHQ>0.02%BHT>0.02%總黃酮；總添加量為0.06%時，其表現出的抗氧化效果和0.02%TBHQ效果相接近。

白骨壤種子；總黃酮；提取工藝；抗氧化性

白骨壤（Aricennia Marina）是我國紅樹林中的先鋒樹種，常見于福建、廣東、廣西、海南、臺灣、香港、澳門沿海，有紅樹林生長的灘涂[1]。白骨壤種子中黃酮類物質不僅含量高而且種類豐富，在民間長期作為藥用，是一種尚未規模開發利用的大然藥物新資源，具有較高的研究開發價值；但是目前國內外對白骨壤的開發利用主要集中在脂肪酸、類固醇和多糖等成分[2-3]。

現代醫學研究表明，黃酮類物質具有降血糖、降血脂、抗心律失常等40多種生理活性[4-5]。此外，黃酮類物質作為抗氧化劑還廣泛應用于食品中[6]。而近年來許多實驗表明，由于合成抗氧化劑對人體的危害，如BHA（丁基烴基茵香醚）對白鼠有致癌作用；BHT（二丁基烴基甲苯）可引起動物肝臟增大等作用，現己限制或停止使用。因此，從藥食兩用植物中篩選出高效低毒目經濟的抗氧化性強的天然抗氧化劑成為人們關注的焦點[7]。但目前對白骨壤種子中黃酮類化合物的提取的報道還很少。本實驗對白骨壤種子中總黃酮的提取工藝進行研究，旨在為白骨壤的開發利用提供理論基礎和實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白骨壤種子：采集于廣西防城港市北侖河口；大豆油：大海糧油工業（防城港）有限公司。

95%乙醇，無水乙醇，氫氧化鈉，六水合氯化鋁，鹽酸等試劑均為國產分析純；蘆丁：中國醫藥（集團）上海化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

HH-4數顯恒溫水浴鍋：金壇市科析儀器有限公司；XMTA-6000溫度調節儀：余姚市亞泰儀器有限公司；101-3型電熱鼓風恒溫干燥箱：上海東星建材試驗設備有限公司；FW-100高速萬能粉碎機：上海勝啟儀器儀表有限公司；FA2004電子分析天平：上海耀杰儀器有限公司；PHS-3CF型精密酸度計：上海大普儀器有限公司；SHZ－D（Ⅲ）循環水式真空泵：上海像華儀器有限公司；UV-160A紫外可見分光光度計：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 白骨壤種子中總黃酮含量測定

參照王作昭和陳叢瑾等的方法[8-9]，總黃酮提取液經過濾后定容至250mL，取定容后濾液1mL置于50mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1.5 mL，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1.5mL，放置6min，加4%氫氧化鈉溶液20 mL，加水至刻度，搖勻，靜置15 min，在510 nm波長處測其吸光度，按以下公式計算總黃酮含量。

式中：A為提取液定容體積，mL；B為吸取測定體積，mL；C 為線性計算出的濃度，（mg/mL）；D 為測定時定容體積，mL；E為稱取的樣品質量，g。

1.3.2 白骨壤果實中總黃酮含量測定的標準曲線繪制

參照何文興等的方法[10]，精密稱取標樣蘆丁20.0mg，用95%乙醇配制成0.1 mg/mL的溶液。分別吸取對溶液 0.0、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，加95%乙醇至3.0 mL，加入1 mL 1%AlCl3-乙醇溶液，95%乙醇乙醇定容，搖勻，放置20 min～30 min，于510 nm處測定其吸光度。以蘆丁標準溶液濃度x和吸光度y繪制標準曲線，并采用二元線性回歸法求回歸方程為y=22.212x+0.0033。結果如圖1所示。

圖1 總黃酮含量標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.3.3 各因素對白骨壤種子中總黃酮提取的影響

稱取粉碎的干燥樣品（過40目篩），加入到具塞錐形瓶中，加入乙醇溶液配成一定的料液比，于恒溫水浴浸提，抽濾，合并濾液，蒸發濾液至無醇味，定容至100 mL。取1 mL樣液置于10 mL比色管中，加入1 mL 1%AlCl3-乙醇溶液，加95%乙醇至刻度。測定下吸光度，計算黃酮類物質含量。各因素對黃酮類物質提取的影響試驗，則在上述試驗的基礎上改變該因素進行。

1.3.4 白骨壤種子中總黃酮提取工藝的優化

在單因素試驗的基礎上，以料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、乙醇濃度（D）等4個因素按照L9（34）正交表進行試驗。正交因素水平表設計如表1所示。

表1 L9（34）正交因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test design on extraction condition of total flavonoids

1.3.5 白骨壤種子中總黃酮抗氧化試驗[11]

采用Schaal烘箱法，取30 g大豆油，放入100 mL燒杯中，敞口，按一定量加入鼠曲草總黃酮樣品或抗氧化劑，混合均勻，將油樣放入（60±0.5）℃恒溫箱中，強化保存，每隔24小時攪拌1次，并交換它們在恒溫箱中的位置，定期測定油樣的過氧化值（POV）。按GB/T 5009.37-2003《食用植物油衛生標準的分析方法》定期測定過氧化值。

2 結果與分析

2.1 液料比對白骨壤種子中總黃酮提取的影響

稱取6份3.0g樣品，加入到6只具塞錐形瓶中，分別加入料液比為 1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60（g/mL）的60%乙醇，50℃水浴浸提4 h，抽濾，合并濾液，蒸發濾液至濾液無醇味后與蒸餾水定容至100 mL，總黃酮測定結果如圖2所示。

圖2 液料比對白骨壤種子中總黃酮提取的影響Fig.2 Effects of ratio of solid to liquid on extraction of total flavonoids

由圖2可知，隨著料液比的增加，總黃酮的提取率逐漸增加；但當料液比超過1:30以后，總黃酮的提取率基本趨于穩定。在實際操作中既要考慮總黃酮的充分溶出，同時也為避免溶劑的浪費，綜合兩方面的因素，固液比設置為 1:30（g/mL）時較佳。

2.2 乙醇濃度對白骨壤種子中總黃酮提取的影響

稱取7份3.0 g樣品，加入具塞錐形瓶中，分別加入料液比為1:30（g/mL），濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，50℃水浴浸提4 h，抽濾，合并濾液，蒸發濾液至濾液無醇味后與蒸餾水定容至100mL，總黃酮測定結果如圖3所示。

圖3 乙醇濃度對白骨壤種子中總黃酮提取的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on extraction of total flavonoids

由圖3可知，隨著乙醇濃度的增大，白骨壤種子中總黃酮提的取得率逐漸增加，因為在濃度較低時，乙醇可以促進總黃酮的溶解；但達到乙醇濃度達到60%以后，隨著乙醇濃度增大，白骨壤種子中總黃酮提的取得率開始下降，這是因為乙醇濃度過大不利于總黃酮的溶解，所以乙醇濃度以60%左右為宜[11]。

2.3 溫度對白骨壤果實中總黃酮提取的影響

稱取7份3.0 g樣品，加入具塞錐形瓶中，分別加入料液比為1:30（g/mL）、濃度為60%的乙醇，于恒溫水浴鍋中 30、40、50、60、70、80 ℃下浸提 4 h，抽濾，合并濾液，蒸發濾液至濾液無醇味后與蒸餾水定容至100 mL，總黃酮測定結果如圖4所示。

圖4 溫度對白骨壤種子中總黃酮提取的影響Fig.4 Effects of temperature on extraction of total flavonoids

由圖4可知，隨著提取溫度的增加，總黃酮提取率也逐漸增加，至60℃時提取率最高，其吸光度為3.95；之后隨著溫度的增加，總黃酮的提取率逐漸下降。可能是因為當提取溫度過低時，乙醇的提取沒有完全；但溫度過高時，乙醇部分蒸發與樣品接觸不完全[12]。

2.4 時間對白骨壤種子中總黃酮提取的影響

稱取7份3.0 g樣品，加入到具塞錐形瓶中，分別加入固液比為1:30（g/mL）濃度為60%的乙醇，60℃水浴，分別浸提 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h，抽濾，合并濾液，蒸發濾液至濾液無醇味后與蒸餾水定容至100 mL，總黃酮測定結果如圖5所示。

圖5 時間對白骨壤種子中總黃酮提取的影響Fig.5 Effects of time on extraction of total flavonoids

由圖5可知，隨著提取時間的增加，黃酮提取率也逐漸增加，在提取時間4.5 h總黃酮提取率達到最高值，其吸光度為3.92 mg/mL；之后隨著時間的增加，總黃酮提取率降低。可能是由于提取時間不夠時，總黃酮并未完全析出；當時間過長時，部分黃酮反被樣品回吸。

2.5 白骨壤種子中總黃酮提取工藝的優化

在上述單因素試驗的基礎上，以料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、乙醇濃度（D）為主要影響因素，按照L9（34）正交表進行提取優化試驗。正交因素水平表和L9（34）正交試驗設計表分別如表2和表3所示。

表2 L9（34）正交試驗設計和結果Table 2 Results and range analysis orthogonal test

由表2的結果可看出，對提取率影響的大小次序為B（提取溫度）＞D（乙醇濃度）＞C（提取時間）＞A（料液比），最佳工藝條件A2B3C3D2。根據最佳工藝條件對白骨壤種子中總黃酮進行提取，測得總黃酮提取率可達 5.89%。

表3 方差分析結果Table 3 Results of variance analysis

由表3方差分析結果可知，顯著水平均大于0.05，即各因素對白骨壤種子中總黃酮提取的影響均無顯著性差異。

因此，綜合考慮生產周期、耗能等各方面因素，采用乙醇恒溫水浴提取白骨壤種子中總黃酮的最佳工藝為料液比 1:30（g/mL）、提取溫度 70℃、提取時間 4.5h，乙醇濃度60%，且此條件下總黃酮提取率可達5.89%。

2.6 白骨壤種子中總黃酮抗氧化性研究

本研究選用大豆油樣品和不同添加量的白骨壤種子中總黃酮進行抗氧化實驗。通過最終過氧化值的差異評價異黃酮的抗氧化性，分析不同添加量與抗氧化性的關系，通過對大豆異黃酮與TBHQ以及BHT的對比實驗評價其抗氧化性的強弱，見圖6。

圖6 總黃酮抗氧化性比較研究Fig.6 Comparative study on total flavonoids antioxidation

由圖6可以看出，大豆油中添加總黃酮的抗氧化性比未添加黃酮（空白）的強，且隨著總黃酮濃度的增加，抗氧化效果增強；相同濃度下，抗氧化效果由強到弱的順序為0.02%TBHQ>0.02%BHT>0.02%總黃酮；總黃酮添加濃度為0.06%時，其表現出的抗氧化效果和人工合成抗氧化劑0.02%TBHQ效果相接近。白骨壤種子總黃酮為天然產物，無毒副作用，顯示了其良好的應用價值。黃酮類化合物B環上的3',4'-鄰二烴基是具有清除自由基生物活性的關鍵結構，其他位上的烴基起一定作用，這可能是由于鄰位烴基的存在可使一個烴基形成碳基之后易與鄰位的烴基形成分了內氫鍵，使氧化后的物質穩定，而中斷自由基導致的鏈反應[14]。

3 結論與討論

1）采用乙醇恒溫水浴提取白骨壤種子中總黃酮的工藝中，4個因素對提取率影響的主次順序次序為B（提取溫度）＞D（乙醇濃度）＞C（提取時間）＞A（料液比）。

2）采用乙醇恒溫水浴提取白骨壤種子中總黃酮的最佳工藝為料液比 1:30（g/mL）、提取溫度 60 ℃、提取時間4.5 h，乙醇濃度60%，且此條件下總黃酮提取率可達5.89%。

3）大豆油中添加總黃酮的抗氧化性比未添加黃酮（空白）的強，且隨著總黃酮濃度的增加，抗氧化效果增強；相同添加量下，抗氧化效果由強到弱的順序為0.02%TBHQ>0.02%BHT>0.02%總黃酮；添加量為0.06%時，其表現出的抗氧化效果和0.02%TBHQ效果相接近。

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Extraction Technology and Antioxidation of Total Flavonoids from Mangrove Plant Aricennia Marina Seed

XIONG Zheng,ZHONG Qiu-ping,LIN Mei-fang,TANG Yuan-yuan
（School of Ocean,Qinzhou University,Qinzhou 535000,Guangxi,China）

The total flavone were extracted from Avicennia marina seeds by ethanol thermostatic water bath method,the optimal extraction conditions of total flavonoids were determined by orthogonal test L9(34)and some research on antioxidation of total flavonoids were taken by the Schaal oven method.The results showed that:the best total flavone extraction conditions were solid to liquid ratio 1:30(g/mL),extraction temperature 60 ℃,extraction time 4.5 h and ethanol concentration 60%,and under these conditions the extraction rate reached 5.89%;Avicennia marina seed total flavone had certain antioxidation on soybean oil,and it had the same dose-effect relationship;the antioxidation from strong to weak order was 0.02%TBHQ>0.02%BHT>0.02%of total flavonoids;under total dosage of 0.06%,the exhibited antioxidation was close to the 0.02%TBHQ.

Avicennia marina seed;total flavonoids;extraction technology;antioxidation

廣西自然科學基金項目（桂科自0991276）；欽州學院科研項目（2008XJKY-13C）

熊拯（1981—），男（漢），講師，研究生，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。

2012-01-24