動物性食品中磺胺二甲嘧啶快速檢測方法

張佳宜

（天津科技大學，天津 300457）

動物性食品中磺胺二甲嘧啶快速檢測方法

張佳宜

（天津科技大學，天津 300457）

根據競爭抑制免疫層析原理，應用膠體金免疫層析技術進行磺胺二甲嘧啶在雞肉和鯽魚中的殘留檢測研究。磺胺二甲嘧啶半抗原-OVA和羊抗兔二抗分別作為檢測帶（T線）和質控帶（C線）包被在硝酸纖維素膜上，金標抗體噴涂在玻璃纖維墊上，制成免疫層析快速檢測試紙條。所建立的檢測體系對標準溶液的靈敏度達到1 μg/L。成功檢測了雞肉和鯽魚中的磺胺二甲嘧啶殘留。該方法靈敏度高，所用試劑無毒、無污染，無需借助儀器，樣品前處理簡便，快速，檢測過程可在10 min內完成，可以作為現場快速檢測動物源性食品中磺胺二甲嘧啶殘留的有效手段。

膠體金；免疫層析；磺胺二甲嘧啶；快速檢測

磺胺二甲基嘧啶（SMZ）是畜牧養殖業中應用最廣泛的磺胺類藥物之一，常被添加到飼料中，用于動物疾病的預防和治療。長期添加或濫用可導致動物性食品中的藥物殘留，人食用含有SMZ藥物殘留的食品后，會影響機體的免疫系統，破壞肌肉、腎臟和甲狀腺等組織，同時SMZ也有致腫瘤傾向[1]。另一方面容易產生耐藥菌株，使藥物失去治療疾病的價值[2]。20世紀90年代以來，SMZ的殘留現象非常嚴重，經常在畜禽和水產品中出現。

目前，檢測SMZ殘留應用最廣泛的是高效液相色譜法[3]。這種方法靈敏度高，但檢測時間長，需特殊儀器，投入成本高，不適用于大量樣本的現場快速篩選。膠體金免疫層析法（GICA）是20世紀90年代出現的一種快速免疫檢測技術，它基于抗原抗體的特異性反應，是將膠體金標記技術、免疫檢測技術和層析分析技術等多種方法有機結合在一起的固相標記免疫檢測技術[4]。該方法最大特點是簡便快速、靈敏準確、成本低廉、不需任何儀器設備，檢測結果清楚，易于判斷。本論文選取雞肉和鯽魚2種檢測樣品，研究了利用免疫膠體金試紙條快速檢測2種樣品中SMZ殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

ZQ2000切條機、HM3020劃膜儀、結合釋放墊、PVC背板：上海金標生物科技有限公司；硝酸纖維素膜、吸收墊、樣品墊：Millipore；氯金酸：上海化學試劑有限公司；SMZ 標準品、羊抗兔二抗、BSA：Sigma；SMZ抗體、包被抗原（SMZ-OVA）：天津市食品營養與安全重點實驗室制備；雞肉和鯽魚為市售，經液相檢測為不含磺胺類藥物的陰性樣品；封閉液：1%BSA-PBS；洗滌液：PBST（含 0.05%Tween-20 的 PBS）；紫外/可見分光光度計：美國CARY 50 Bio，Varian。

1.2 膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法[5]制備40 nm膠體金：1%的檸檬酸三鈉水溶液1 mL加入到100 mL 0.01%的HAuCl4水溶液中。

1.3 膠體金標記抗體蛋白

取20 mL膠體金溶液，用0.1 mol/L的K2CO3調節pH到9.0，在磁力攪拌下，逐滴加入0.48 mg純化后的抗體，10 min后逐滴加入10%的BSA使溶液中BSA終濃度為1%，以穩定膠體金標記物，攪拌30 min后置于4℃過夜。分裝到1 mL離心管中，10000 r/min離心30 min，棄上清。用儲存液溶解，重復上一步離心，棄上清，用儲存液重懸為原體積的1/10，4℃保存備用。

1.4 試紙條的組裝

用劃膜儀將羊抗兔二抗（0.5 μL/strip）與SMZOVA（0.8 μg/strip）包被在 NC 膜上，作為質控帶和檢測帶；將金標抗體稀釋后30 μL/cm噴涂于玻璃纖維上，作為結合釋放墊。在PVC背板上依次粘貼吸收墊、硝酸纖維素膜、結合釋放墊、樣品墊，然后用切條機切成條狀（60 mm×4 mm），密封干燥保存。

1.5 方法檢出限的測定

將SMZ標準品用含10%甲醇的PBST溶液稀釋成一系列梯度，將制備好的試紙條插進上述梯度稀釋液中進行競爭反應，5 min后取出，目視辨別顏色深淺，在質控帶顯色的情況下，檢測帶顏色越淺，代表SMZ含量越高。以能與空白對照有明顯色差的最小濃度為最低檢出限。

1.6 樣品預處理

雞肉：稱取2 g樣品，加4 mL甲醇旋渦振蕩提取2 min，過濾，濾液用PBST稀釋10倍待測。

鯽魚：稱取2 g樣品，加4 mL甲醇旋渦振蕩提取2 min，過濾，濾液用PBST稀釋5倍待測。

1.7 樣品的檢測

對于2種樣品采用對待測物（SMZ）進行添加回收的方法，向雞肉和鯽魚2種陰性樣品中分別添加3個不同含量水平（雞肉添加 20、100、400 μg/kg；鯽魚添加10、50、200 μg/kg）的 SMZ，按照 2.7 的樣品預處理方法，提取后用膠體金試紙條進行檢測。

1.8 穩定性試驗

將制作好的試紙條置于4℃冰箱內密封保存。分別在 1、2、3、4、5、6 個月時取出進行一系列濃度標樣的測定，每次3組，觀察檢測線和質控線的有無，條帶的清晰度以及玻璃纖維釋放金標抗體的程度。

2 結果

2.1 膠體金質量鑒定

膠體金溶液500 nm～600 nm的紫外掃描圖譜，如圖1。

圖1 膠體金的500 nm～600 nm紫外掃描圖Fig.1 Spectrum(500 nm-600 nm)of colloidal gold

只有一個最大的吸收峰λmax=525 nm，OD525=1.588，而且峰寬較小，波形光滑，說明制得的膠體金溶液的顆粒大小比較均勻。

用肉眼觀察，可見膠體金溶液外觀呈深紅色，色澤均勻清亮，表面沒有漂浮物。經膠體金電鏡觀察結果如圖2。

圖2 膠體金的電鏡掃描圖Fig.2 Transmission electron micrograph of colloidal gold

從圖2可以看出所制備的膠體金顆粒大小均勻，最終測得的粒徑平均大小（n=50）為40 nm。

2.2 檢出限的確定

圖3為在最佳的試驗條件下檢測不同濃度SMZ的結果示意圖。

結果表明：隨著SMZ濃度的升高，檢測帶逐漸變淺。當SMZ濃度低于1 μg/L時，檢測線顯色結果與空白溶液（不含SMZ）相比無法通過目測區別，當SMZ的濃度為1 μg/L，顏色與空白溶液雖然很接近，但仍能通過目測將兩者區分，因此膠體金免疫層析法檢測SMZ的方法檢出限為1 μg/L。

圖 3 GICA 實驗結果（SMZ 濃度從左至右為：0、1、5、20 μg/L）Fig.3 Detection by GICA(the concentration of SMZ from left to right:0,1,5,20 μg/L)

2.3 樣品的測定

向雞肉和鯽魚兩種動物性食品中分別添加一定濃度的SMZ，結果如圖4所示。

圖4 SMZ試紙條對2種樣品的添加回收實驗結果Fig.4 Determination of SMZ in four spiked samples

由圖4表明：對于2種樣品，當添加SMZ濃度分別為20 μg/kg和10 μg/kg時，檢測帶顏色能通過目測與空白區分。能夠滿足我國及國外所規定的磺胺二甲基嘧啶在所有可食用組織和奶中最高殘留限量（20 μg/kg）的要求。且由圖4可看出，添加不同濃度SMZ的樣品都可以得到明顯的梯度，說明所優化的提取方法有效，適合現場快速檢測。

2.4 穩定性試驗

試紙條在4℃條件下放置6個月仍然穩定可靠，梯度明顯，結合釋放墊釋放完全，條帶清晰，試紙條具有很好的穩定性。6個月后穩定性開始下降，整體顏色變淺，不能正確判定檢測結果，因此無法用于樣品的檢測。最后確定SMZ試紙條的保存條件是在4℃干燥的條件下密封保存，有效期至少6個月。

3 結論與討論

采用檸檬酸三鈉還原法制備了40 nm膠體金，標記抗磺胺二甲嘧啶多克隆抗體，優化建立了免疫膠體金快速檢測方法，選取雞肉和鯽魚兩種動物性食品，在2種樣品中SMZ的檢測限分別達到20 μg/kg和10 μg/kg，均滿足國內外規定的磺胺二甲基嘧啶最高殘留限量的要求。通過穩定性實驗，確定SMZ試紙條的保存期限為4℃下密封干燥保存6個月，為進一步研發磺胺類獸藥殘留檢測試劑盒提供參考。樣品前處理方法以及測定過程快速，簡便，檢測方法特異性強，靈敏度高，適用于動物源性食品中磺胺二甲嘧啶殘留的大批量現場檢測，在今后的獸藥殘留檢測領域將會發揮越來越重要的作用。

[1]Sashenbrecker PW,Fish NA.Sulphamethazine residues in uncooked edible tissues of pork following recommended oral administration and withdrawal[J].Canadian journal of comparative medicine,1980,44(3):338-345

[2]Printhipal Singh.Enzyme immunoassay for screening of suifamethazine in swine[J].Agric Food Chem,1989,37(1):109-114

[3]王曼霞,林黎明,劉心同,等.高效液相色譜法測定動物組織中8種磺胺類藥物殘留量[J].化學分析計量,2004,13(2):14-16

[4]嚴華,申厚鳳.膠體金免疫層析技術的應用與展望[J].微生物學免疫學進展,2005,33(3):86-89

[5]Frens G.Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold solution[J].Nature physical science,1973(105):20-22

Development of Rapid Detection Assay for Sulphamethazine Residues in Animal Foods

ZHANG Jia-yi
（Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China）

The objective of the study is to establish a competitive assay based on the principle of immunoassay for the rapid on-site detection of Sulphamethazine(SMZ)residues in chicken and fish muscle.The SMZ-OVA and goat anti-rabbit IgG were dispense on test line and control line respectively and the polyclonal antibody was solidified to glass fibers to prepare immunochromatographic strips.The visual detection limit for SMZ is 1 μg/L.The test strip was used to detect SMZ from chicken and fish muscle samples spiked with SMZ standard solution.The method established is sensitive,the reagent is innocuous and free from contamination and that the procedure of determination is simple and quick,costing 10 minutes.It was proved to be widely used to detect the SMZ residues in animal foods on-site.

colloidal gold;immunochromatographic;SMZ;rapid detection

張佳宜（1983—），女（漢），實驗師，碩士研究生，研究方向：化學、食品安全。

2011-12-27