淋球菌NspA核酸疫苗小鼠體內(nèi)誘生保護(hù)性抗體研究

崔 婷

江蘇省揚(yáng)州市江都區(qū)仁和堂藥房，江蘇揚(yáng)州 225200

淋球菌NspA核酸疫苗小鼠體內(nèi)誘生保護(hù)性抗體研究

崔 婷

江蘇省揚(yáng)州市江都區(qū)仁和堂藥房，江蘇揚(yáng)州 225200

目的 進(jìn)一步研究前期構(gòu)建淋球菌NspA真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcNspA作為淋病核酸疫苗的可行性。方法 將pcNspA分別通過(guò)肌內(nèi)注射（IM）、滴鼻（IN）和陰道接種（IVAG）等3種途徑免疫BALB/c小鼠，對(duì)免疫鼠的血清、支氣管肺泡和陰道洗液等樣品分別用間接ELISA檢測(cè)淋球菌特異性抗體的類(lèi)型和效價(jià)，比較不同接種途徑刺激小鼠體內(nèi)特異性抗體水平的差異以及相應(yīng)抗體的體外溶菌活性。結(jié)果pcNspA質(zhì)粒經(jīng)滴鼻免疫和肌內(nèi)注射均可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的特異性體液免疫水平，尤其是滴鼻免疫途徑不僅可誘生較高水平的血清IgG抗體（1∶1 600），而且在支氣管肺泡洗液和陰道洗液中均可檢測(cè)到特異性sIgA的存在。而陰道接種pcNspA質(zhì)粒僅能在陰道局部檢測(cè)到較低水平的特異性sIgA。用pcNspA質(zhì)粒誘生的血清IgG抗體做體外溶菌活性實(shí)驗(yàn)，證實(shí)滴鼻免疫小鼠血清具有溶菌活性。結(jié)論 淋球菌NspA基因疫苗可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體，并對(duì)機(jī)體有免疫保護(hù)作用；滴鼻可能是淋球菌NspA核酸疫苗的一個(gè)有效接種途徑。

淋球菌；NspA；核酸疫苗；小鼠

淋病奈瑟菌（俗稱(chēng)淋球菌）是淋病的病原菌。隨著抗生素的廣泛使用，淋球菌的耐藥性現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，給淋病的治療帶來(lái)了極大困難[1]。因此，可有效預(yù)防淋球菌感染的理想疫苗研制目前尤為重要。已報(bào)道的一些淋球菌疫苗候選抗原如孔蛋白Por、菌毛蛋白Pil、菌落不透明相關(guān)蛋白Opa、脂寡糖Los等，均存在一度的變異性，因此人們一直在尋找具有免疫保護(hù)性的保守抗原。1999年Martin P等[2]首先克隆了淋球菌表面蛋白 A（neisseria surface protein A，NspA）的基因，并證明淋球菌菌株之間NspA氨基酸序列的同源性高達(dá)98%。用同位素標(biāo)記的NspA單抗和淋球菌結(jié)合，證實(shí)NspA位于完整的細(xì)菌表面。本室構(gòu)建了淋球菌NspA真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒重組載體pcNspA[3]，本文將pcNspA經(jīng)肌內(nèi)注射、滴鼻和陰道接種3種途徑核酸免疫BALB/c小鼠，研究了NspA核酸免疫在小鼠體內(nèi)誘生特異性抗體的作用。

1 資料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

DH5α大腸桿菌、NspA真核表達(dá)載體pcNspA由揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供[3]。4～6周齡BALB/c小鼠（雌性，體重約19 g）由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2002-0009，使用許可證號(hào)：SCXK（蘇）2002-0045。 將 50 只 6周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只。分別記作空白對(duì)照組（PBS）、陰性對(duì)照組（pCMV-script）、pcNspA 肌內(nèi)注射組（IM）、pcNspA 滴鼻免疫組（IN）、pcNspA 陰道接種組（IVAG）。

1.2 主要試劑

PEI（25kDa） 為Sigma公司產(chǎn)品；Columbia Agar為法國(guó)bioMérierx sa公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgA購(gòu)自USB公司，羊抗鼠IgG的HRP酶標(biāo)二抗購(gòu)自北京華美生物工程公司。

1.3 免疫小鼠

大量提取質(zhì)粒pcNspA和pCMVScript，免疫時(shí)重組質(zhì)粒與 PEI按 1∶2的質(zhì)量比混勻，37℃放置 15 min后免疫小鼠。第0、2、3和4周分別免疫1次。IM組于每次免疫前24 h先在每只小鼠股四頭肌注射0.25 mg蔗糖，然后于相同部位注射100 μg質(zhì)粒；IN組小鼠先用乙醚麻醉后再將100 μg質(zhì)粒緩慢滴進(jìn)每只小鼠鼻腔；IVAG組先輕輕按摩刺激小鼠排泄糞便，然后將質(zhì)粒以100 μg/只劑量用移液器注入小鼠陰道。

1.4 樣本收集

最后一次免疫后2周分別收集各免疫組小鼠的血清、支氣管肺泡和陰道洗液等樣本。收集血清：摘除眼球取血，37℃孵育2 h，12 000×g離心5 min后吸取上清；收集陰道洗液：以200 μL PBS緩慢沖洗陰道約9次，收集的洗液經(jīng)12 000×g離心10 min后吸取上清[4]；收集支氣管肺泡洗液：脫頸椎處死小鼠，于氣管環(huán)狀軟骨處切一小口，用30 μL PBS緩慢沖洗肺部3次，收集洗液，12 000×g離心5 min后取上清[5]。上述樣本均于-70℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 全細(xì)胞ELISA

按文獻(xiàn)[2]方法進(jìn)行。收集培養(yǎng)18 h的淋球菌細(xì)胞，以生理鹽水懸浮后分光光度計(jì)調(diào)整至OD600=1.0。取 100 μL菌懸液置于微孔板的小孔中，37℃過(guò)夜烘干，PBST洗滌3次。用含3%小牛血清蛋白的PBS封閉，37℃孵育30 min后棄去封閉液，PBST洗滌3次。每孔加入系列稀釋的100 μL待測(cè)樣品，37℃孵育1 h后用PBST洗滌3次。每孔加入100 μL HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgA稀釋液或羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次。加顯色底物溶液100 μL，15 min后加顯色終止液，用酶標(biāo)儀讀取A490值?？蛰d體免疫的小鼠樣本作為陰性對(duì)照，P/N≥2.1時(shí)樣品的最大稀釋倍數(shù)作為特異性抗體的效價(jià)。

1.6 補(bǔ)體依賴(lài)性抗體殺菌實(shí)驗(yàn)

按文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：將400 CFU淋球菌和小鼠抗血清混合，并加入新鮮人血清作為補(bǔ)體，100 μL反應(yīng)體系中抗血清的稀釋稀釋度分別為 1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280，人血清濃度均為10%。37℃孵育30 min后將反應(yīng)液鋪于淋球菌瓊脂平板，于36℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約20 h，計(jì)數(shù)平板上長(zhǎng)出的淋球菌菌落。1∶80空載體免疫鼠血清為陰性對(duì)照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清中特異性IgG水平

間接ELISA檢測(cè)不同免疫途徑誘生小鼠血清中淋球菌特異性IgG水平，結(jié)果見(jiàn)圖1，以IM、IN和IVAG等3種途徑分別給小鼠免疫pcNspA后，IM組和IN組小鼠血清中淋球菌特異性IgG抗體效價(jià)最高，均可達(dá)到1∶1 600，兩組小鼠血清中特異性IgG抗體水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05），但與IVAG組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 血清中特異性IgA水平

間接ELISA檢測(cè)不同免疫途徑誘生小鼠血清中淋球菌特異性IgA水平，結(jié)果表明IM與IN組小鼠血清中特異性IgA水平相近，均高達(dá)1∶1 600，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但二者均與IVAG組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。

2.3 支氣管肺泡和陰道洗液中特異性sIgA水平

由表1可見(jiàn)，IN組小鼠支氣管肺泡洗液中特異性sIgA水平最高（120±75）；IM 小鼠次之（100±77）；IVAG 組小鼠未檢測(cè)到支氣管肺泡洗液洗液中的特異性sIgA。

IN組和IVAG組小鼠的陰道洗液中可檢測(cè)到一定效價(jià)的特異性sIgA，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；IM組小鼠未檢測(cè)到陰道洗液中的特異性sIgA。

表1 不同接種途徑刺激小鼠產(chǎn)生的淋球菌特異性sIgA水平（±s）Tab.1 The titer of gonococcus specific sIgA in lung lavage fluids and vaginal fluids from mice immunized by pCNspA via different routes，respectively(±s)

表1 不同接種途徑刺激小鼠產(chǎn)生的淋球菌特異性sIgA水平（±s）Tab.1 The titer of gonococcus specific sIgA in lung lavage fluids and vaginal fluids from mice immunized by pCNspA via different routes，respectively(±s)

組別 肺泡洗液sIgA效價(jià) 陰道洗液sIgA效價(jià)PBS control pCMV-script pcNspA IN pcNspA IM pcNspA IVAG－ －－ －120±75 100±77－100±65－100±60

2.4 免疫小鼠抗血清的補(bǔ)體依賴(lài)性殺菌活性

根據(jù)ELISA檢測(cè)上述樣品中特異性抗體的效價(jià)，選用IN組小鼠抗血清進(jìn)行抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體溶菌活性試驗(yàn)。由圖3可以看出，不同稀釋度的免疫血清均具有一定的抗菌活性，而1∶80稀釋的血清表現(xiàn)的溶菌活性最強(qiáng)。

3 討論

Por、Pil、Opa和LOS等淋球菌抗原均有較高的變異性，而NspA則高度保守，是淋病有效疫苗的理想候選抗原。本研究利用前期構(gòu)建的pcNspA，比較了3種不同接種途徑核酸免疫小鼠誘生的特異性抗體效價(jià)及抗菌活性，為淋病疫苗研制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

IM可刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的全身性免疫反應(yīng)，也是核酸疫苗的首選接種途徑，淋病疫苗研究中也大都采用基因槍或注射方法進(jìn)行肌肉免疫[6-7]。但I(xiàn)M免疫誘導(dǎo)的黏膜免疫效果并不理想[8]，而淋球菌正是通過(guò)黏膜系統(tǒng)造成泌尿生殖道、眼結(jié)膜、咽部或者直腸等局部感染。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)肌內(nèi)注射pcNspA的小鼠血清中產(chǎn)生了較高水平的淋球菌特異性IgG和IgA，支氣管肺泡洗液中可誘生一定的sIgA，但陰道洗液中未能檢測(cè)到sIgA。

IN簡(jiǎn)便易行、相對(duì)安全，可誘生較強(qiáng)的全身性免疫，黏膜免疫反應(yīng)水平也較高[8]，可在小鼠下生殖道誘生抗原特異性抗體[9]。小鼠鼻腔后部雙側(cè)具有條形鼻黏膜相關(guān)淋巴組織[10]，與人類(lèi)Waldeyer's環(huán)相似，是上呼吸道的免疫誘導(dǎo)部位?；蛞呙绫晃降奖乔火つど掀ず罂杀籑細(xì)胞攝取并跨膜運(yùn)送到鼻相關(guān)淋巴組織，然后致敏的淋巴細(xì)胞通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)遷移到其他的黏膜效應(yīng)部位產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明滴鼻免疫組小鼠的血清IgG及IgA、支氣管肺泡洗液sIgA和陰道洗液sIgA與對(duì)照組相比都差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且滴鼻免疫組誘導(dǎo)產(chǎn)生的血清特異性IgG、IgA水平與肌內(nèi)注射免疫組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明滴鼻免疫NspA基因不僅可以和傳統(tǒng)的肌內(nèi)注射方法一樣有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，還能在黏膜系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，發(fā)揮更強(qiáng)大的免疫保護(hù)作用。

陰道接種是另一種黏膜免疫途徑，盡管還沒(méi)有證據(jù)表明在陰道黏膜有淋巴濾泡或者M(jìn)細(xì)胞的存在，但陰道黏膜免疫接種可以在陰道局部產(chǎn)生免疫應(yīng)答[11]。不過(guò)以現(xiàn)有的免疫佐劑和免疫方案，在嚙齒類(lèi)動(dòng)物進(jìn)行陰道免疫接種的免疫效果不佳[12-13]，可能因?yàn)樯车赖木植棵庖邞?yīng)答很大程度上受到鼠類(lèi)體內(nèi)激素水平的影響，其免疫應(yīng)答水平隨著機(jī)體動(dòng)情期的改變而改變。在本實(shí)驗(yàn)中，小鼠陰道途徑接種NspA基因疫苗后，僅在陰道洗液中發(fā)現(xiàn)存在少量特異性sIgA，不能誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫應(yīng)答。

在對(duì)淋球菌疫苗的研究過(guò)程中，一般認(rèn)為特異性抗體的補(bǔ)體依賴(lài)性殺菌作用是疫苗可產(chǎn)生保護(hù)性的有力證據(jù)[6]，在缺少合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的現(xiàn)狀下，體外殺菌試驗(yàn)的結(jié)果不僅可以評(píng)估特異性抗體對(duì)機(jī)體免疫保護(hù)作用，還可以進(jìn)而了解到該疫苗對(duì)潛在的外來(lái)細(xì)菌入侵的清除防范能力。對(duì)滴鼻免疫小鼠血清中的NspA特異性抗體做進(jìn)一步的功能研究，顯示產(chǎn)生的特異性抗體可以在體外介導(dǎo)補(bǔ)體發(fā)揮溶解細(xì)菌的作用。

綜上所述，淋球菌NspA核酸疫苗的免疫原性較強(qiáng)，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生淋球菌特異性保護(hù)性抗體。與其他接種途徑相比，IN免疫誘導(dǎo)的全身性和黏膜免疫應(yīng)答均最強(qiáng)，是淋病核酸疫苗的有效接種途徑。

[1]Stefanelli P.Emerging resistance in Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae[J].Expert Rev Anti Infect Ther，2011，9（2）：237-244.

[2]Martin P，Nathalie C，Rioux CR，et al.Antigenic and molecular conservation of the gonococcal NspA protein[J].Infection and Immunity，1999，67（6）：2855-2861.

[3]季明春，陳紅菊.奈瑟氏淋球菌表面蛋白A基因克隆及在真核細(xì)胞中的表達(dá)研究[J].微生物學(xué)報(bào)，2004，44（1）：44-46.

[4]張欣，陳磊，陶欣，等.HIV-1CN54 DNA疫苗滴鼻免疫小鼠誘發(fā)系統(tǒng)和黏膜免疫應(yīng)答[J].免疫學(xué)雜志，2003，19（6）：415-419.

[5]Ichinohe T，Ainai A，Nakamura T，et al.Induction of cross-protective immunity against influenza A virus H5N1 by an intranasal vaccine with extracts of mushroom mycelia[J].J Med Virol，2010，82（1）：128-137.

[6]Zhu W，Thomas CE，Sparling PF.DNA immunization of mice with a plasmid encoding Neisseria gonorrhoeae PorB protein by intramuscular injection and epidermal particle bombardment[J].Vaccine，2004，22（5-6）：660-669.

[7]Bos MP，Tefsen B，Voet P，et al.Function of neisserial outer membrane phospholipase a in autolysis and assessment of its vaccine potential[J].Infect Immun，2005，73（4）：2222-2231.

[8]Jabbal-Gill I.Nasal vaccine innovation[J].J Drug Target，2010，18（10）：771-786.

[9]Lu L，Palaniyandi S，Zeng R，et al.A neonatal Fc receptor-targeted mucosal vaccine strategy effectively induces HIV-1 antigen-specific immunity to genital infection[J].J Virol，2011，85（20）：10542-10553.

[10]Canessa C，Vierucci S，Azzari C，et al.The immunity of upper airways[J].Int J Immunopathol Pharmacol，2010，23（1 Suppl）：8-12.

[11]Carmichael J R，Pal S，Tifrea D，et al.Induction of protection against vaginal shedding and infertility by a recombinant Chlamydia vaccine[J].Vaccine，2011，29（32）：5276-5283.

[12]Russell MW.Immunization for protection of the reproductive tract：a review[J].Am J Reprod Immunol，2002，47（5）：265-268.

[13]Wegmann F，Krashias G，Luhn K，et al.A novel strategy for inducing enhanced mucosal HIV-1 antibody responses in an anti-inflammatory environment[J].Plos One，2011，6（1）：e15861.

Study on the protective antibodies induced in mice by nucleic acid vaccine of neisseria gonorrhoeae NspA

CUI Ting
Renhe Tang Pharmacy of Jiangdu District of Yangzhou City in Jiangsu Province,Yangzhou 225200,China

Objective To further study the feasibility of constracting express plasmid pcNspA of eukaryotic cell of neisseria gonorrhoeae NspA in the earlier stage.Methods The BALB/c mice were immunized with pcNspA in three different ways of intramuscular injection(IM),nasal drip(IN)and vaginal vaccination(IVAG)respectively.The samples like serum,bronchoalveolar and vaginal lotion of immunized mice were respectively used by indirect detection of ELISA to detect the types and valence of specific antibodies of neisseria gonorrhoeae.The differences of the level of specific antibodies in mice and the bacteriolytic activities in vitro of corresponding antibodies stimulated by different routes of inoculation were compared.Results The plasmid pcNspA could induce higher specific humoral immune level in mice by both ways of nasal drip and intramuscular injection.Specially,the immunization route of nasal drip not only could induce higher level of serum IgG antibodies(1∶1 600),but also could detect the existence of specific sIgA in both bronchioloalveolar lotion and vaginal lotion.While vaginal inoculation pcNspA plasmid could only detect lower level of specific sIgA in local vagina.The serum IgG antibodies induced by pcNspA plasmi was used to carry on the experiment of bacteriolytic activities in vitro,which showed that there were hypha activities in the serum of mice immunized by nasal drip.Conclusion The neisseria gonorrhoeae NspA can induce specific antibodies in mice,and has an immunity protection for organism.The nasal drip may be an effective vaccination way of nucleic acid vaccine of neisseria gonorrhoeae NspA.

Neisseria gonorrhoeae;NspA;Nucleic acid vaccine;Mice

R-332

A

1674-4721（2012）08（c）-0005-03

2012-05-11 本文編輯：趙麗萍）