腦紅蛋白在腦梗死大鼠腦組織中的表達及其神經保護作用機制

張 蓓，李亞軍，張世俊，任會云，王敏娟，郭長江

（西安醫學院附屬醫院神經內科，陜西 西安710077）

腦紅蛋白在腦梗死大鼠腦組織中的表達及其神經保護作用機制

張 蓓，李亞軍，張世俊，任會云，王敏娟，郭長江

（西安醫學院附屬醫院神經內科，陜西 西安710077）

目的：觀察腦梗死大鼠腦組織中腦紅蛋白 （Ngb）的表達及其對PI3K／Akt信號通路的影響，探討二者在缺血性腦損傷中的作用及Ngb神經保護作用的可能機制。方法：60只SD大鼠隨機分為假手術組、缺血組、Hemin（Ngb誘導劑）組、LY （PI3－K／Akt抑制劑LY294002）組和Hemin＋LY組，每組12只。應用大腦中動脈線栓法制備腦梗死動物模型，術后24h觀察各組大鼠神經功能評分和腦組織梗死體積；應用RT－PCR法檢測各組大鼠腦組織Ngb mRNA表達水平及PI3－K／Akt活性。結果：假手術組未見TTC不著色區，未檢出神經功能缺損。與缺血組比較，Hemin組大鼠腦組織中Ngb和Akt mRNA表達水平升高 （P＜0.01），神經功能評分降低 （P＜0.05），腦梗死體積減小 （P＜0.01）；與缺血組比較，LY組大鼠腦梗死體積增加 （P＜0.01），神經功能評分升高 （P＜0.05），Akt mRNA表達水平降低 （P＜0.01），Ngb無明顯變化。與 Hemin組比較，Hemin＋LY組大鼠腦組織損傷加重，Akt mRNA表達水平明顯降低 （P＜0.01），Ngb未被抑制。結論：Ngb可以減小局灶性腦缺血大鼠腦梗死體積，改善神經功能，并且可能通過PI3K／Akt信號通路發揮神經保護作用。

腦紅蛋白；磷脂酰肌醇－3激酶／絲氨酸－蘇氨酸蛋白激酶；腦梗死

腦血管病是危害極大的常見病、多發病，目前尚缺乏切實有效的腦保護劑。腦紅蛋白（neuroglobin，Ngb）是近年發現的一種主要表達于腦內神經元的攜氧球蛋白。腦缺血缺氧時，Ngb在神經元中高度表達，并可作為一種內源性神經保護因子增強腦組織對缺血－缺氧損傷的耐受［1］，但其確切機制尚不明確，國內外罕見其信號通路的相關文獻報道。氯化高鐵血紅蛋白 （Hemin）又名正鐵血紅素，臨床上廣泛應用于治療貧血。Hemin在細胞和整體水平均能誘導神經細胞Ngb高表達［2－3］。本研究旨在進一步觀察Ngb對腦梗死大鼠的神經保護作用，并探討其是否通過激活磷脂酰肌醇－3 激 酶 （phosphoinositide－3kinase，PI3K）／絲氨酸－蘇氨酸蛋白激酶 （serine／threonine kinase，Akt）信號通路而實現；揭示這一保護作用的具體機制及可能涉及的信號轉導途徑不僅為開展Ngb的臨床應用提供重要的理論依據，而且有可能為缺血性卒中甚至各種原因導致的缺氧性腦損傷帶來全新的、可行的治療方案。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康成年雄性SD大鼠60只 （西安交通大學醫學院實驗動物中心提供），體質量 （280±20）g，隨機平均分為假手術組、缺血組、Hemin組 （于術后1h腹腔注射Ngb誘導劑 Hemin 50mg·kg－1）、LY組 （PI3K／Akt抑制劑LY294002，0.3mg·kg－1于栓塞前15min經尾靜脈給藥）和Hemin＋LY組 （于相應時間點分別給予Hemin和LY294002），每組12只。

1.2 主要試劑 Trizol試劑盒 （Gibco公司），逆轉錄反應試劑盒 （Takara公司），PCR擴增試劑盒和DNA梯度Marker（Takara公司），RNA提取試劑盒 （Tiangen公司），Hemin（上海麗珠生物技術有限公司），LY294002（Santa Cruz公司）。

1.3 動物模型制備 參照 Zea－longa法［4］改良后制作右側大腦中動脈閉塞模型：大鼠經10%水合氯醛 （0.3mg·kg－1）腹腔注射麻醉后仰臥位固定，備皮，消毒，沿頸前正中線切開皮膚，逐層分離，暴露右側頸總動脈 （CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內動脈 （ICA），結扎ECA及CCA近心端，經CCA近分叉處切口插入線栓 （4－0單絲尼龍手術縫合線，頭端加熱成直徑0.3mm光滑球形，酒精消毒、肝素浸泡后備用），進入ICA 18～20mm至大腦中動脈起始處，結扎固定線栓。假手術組僅分離暴露頸部動脈不阻斷血流。

1.4 大鼠神經功能評定 術前及術后24h參照Zea－longa［4］標準進行神經功能評定。0分：無神經功能缺損；1分：不能完全伸展左側前爪；2分：向左側轉圈；3分：行走時向左側傾倒；4分：不能自發行走，有意識障礙。1～4分視為造模成功，術前評分大于0分及術后評0分或術后24h內死亡者剔除，并隨機補足。

1.5 大鼠腦梗死體積測定 每組各取6只大鼠于術后24h斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，以前囟 （Bregma）為標志點，從Bregma＋4.0mm～Bregma－8.0mm，以2mm間隔行連續冠狀切片，共6片，放入1%紅四氮唑 （TTC）磷酸鹽緩沖液中 （pH ＝7.4），37℃孵育30min。正常大鼠腦組織著深紅色，梗死灶呈蒼白色。4%多聚甲醛固定，拍照，利用Photoshop等軟件計算腦梗死體積。腦梗死體積計算公式：V＝t× （A1＋A2＋…An），V代表腦梗死體積，t代表腦片的厚度，A代表腦片的梗死面積。

1.6 RT－PCR方法檢測大鼠腦組織中Ngb及Akt mRNA表達水平 每組動物各取6只，術后24h斷頭取腦，迅速置于液氮中保存備用。①基因引物：采用Primer 5.0軟件設計PCR引物，由上海生工生物技術有限公司合成。Ngb上游序列，5′－AGCCGCAGCCCTCTGGAACA－3′，下游序列5′－GCAGCATCAATCACAAGCA－3′， 擴 增 長 度176bp；Akt 上 游 序 列，5′－CTGGCCAGGCCCAAGCACCG－3′，下 游 序 列，5′－CGTTCACTGTCCACACACTC－3′，擴增長度109bp；GAPDH 為 內 參 照，上 游 序 列，5′－ACCACCATGGAGAAGGCTGG－3′，下游序列，5′－CTCAGTGTAGCCCAGGATGC－3′，擴 增 長 度 為 528bp。②腦組織總RNA的提?。菏褂每俁NA提取試劑盒，按其說明提取大鼠腦組織總RNA，并經紫外分光光度計定量。③RNA逆轉錄合成cDNA。④RT－PCR反應：94℃預變性2min；94℃、1min，55℃、1min，72℃、1.5min，共 28 個 循 環；72℃延伸7min。⑤采用紫外－凝膠成像分析系統（Alphalmager2200）記錄電泳結果，采用Image J軟件定量分析電泳結果。上述實驗重復3次。

1.7 統計學分析 采用SPSS 17.0統計學軟件進行統計學處理。大鼠神經功能評分、腦組織Ngb及Akt mRNA的表達水平以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠死亡率比較 假手術組大鼠無死亡，缺血組和LY組各死亡2只，Hemin組死亡1只（術中損傷迷走神經迅速死于急性肺水腫），Hemin＋LY組死亡1只。以上大鼠不進入統計，另隨機選取大鼠補齊。各組大鼠死亡率比較差異無統計學意義 （P＞0.05）。

2.2 各組大鼠神經功能評分和腦梗死體積 假手術組全部大鼠未檢測到神經功能缺損 （0分），其余各組大鼠術后24h均有不同程度的神經功能缺損：Hemin組大鼠神經功能評分明顯低于缺血組（P＜0.05），LY組大鼠神經功能評分高于缺血組（P＜0.05），Hemin＋LY組與缺血組大鼠神經功能評分比較差異無統計學意義 （P＞0.05）。假手術組大鼠腦組織未見TTC不著色區，Hemin組腦梗死體積小于缺血組 （P＜0.01）。LY組腦梗死體積大于缺血組 （P＜0.01）；Hemin＋LY組腦梗死體積小于 LY 組 （P＜0.01），大于 Hemin組（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分和腦梗死體積Tab.1 Neurological function score and cerebral infarction volume of rats in various groups （±s）

表1 各組大鼠神經功能評分和腦梗死體積Tab.1 Neurological function score and cerebral infarction volume of rats in various groups （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs ischemia group ；△P＜0.01 vs Hemin group；＃P＜0.01 vs LY group.

Group Neurological scoreCerebral infarction volume（V／mm3）eration 0 0 Ischemia 2.98±0.76 179.50±3.94 Hemin 2.13±0.54＊ 86.67±5.89＊＊LY 3.42±1.01＊ 225.00±3.46＊＊Hemin＋LY 2.87±0.62△＃ 188.67±2.42＊△＃Sham op

2.3 各組大鼠腦組織中Ngb和Akt mRNA的表達水平 假手術組大鼠腦組織Ngb mRNA僅有少量表達。與假手術組比較，缺血組大鼠腦組織中Ngb mRNA表達水平明顯增高 （P＜0.01），但Akt mRNA表達水平降低 （P＜0.01）。與缺血組比較，Hemin組大鼠腦組織中Ngb和Akt mRNA表達水平均升高 （P＜0.01）；LY組Akt mRNA表達水平降低 （P＜0.01），Ngb mRNA無明顯變化（P＞0.05）；Hemin＋LY組Ngb mRNA被誘導高表達 （P＜0.01），Akt mRNA表達水平降低（P＜0.05）。與Hemin組比較，Hemin＋LY組大鼠腦組織中Akt mRNA表達水平明顯降低 （P＜0.01），Ngb mRNA表達水平兩組比較差異無統計學意義 （P＞0.05）。與LY組比較，Hemin＋LY組大鼠腦組織中Ngb和Akt mRNA均在Hemin誘導下表達水平升高 （P＜0.01）。見圖1和表2。

圖1 各組大鼠腦組織中Ngb和Akt mRNA表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of Ngb and Akt mRNA in brain tissue of rats in various groupsLane 1：Sham operation group；Lane 2：Ischemia group；Lane 3：Hemin group；Lane 4：LY group；Lane 5：Hemin＋LY group.

表2 RT－PCR檢測各組大鼠腦組織中Ngb和Akt mRNA表達水平Tab.2 RT－PCR analysis of expression levels of Ngb and Akt mRNA in brain tissue of rats in various groups（n＝6，±s）

表2 RT－PCR檢測各組大鼠腦組織中Ngb和Akt mRNA表達水平Tab.2 RT－PCR analysis of expression levels of Ngb and Akt mRNA in brain tissue of rats in various groups（n＝6，±s）

＊P＜0.01 vs sham operation group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs ischemia group；＃P＜0.01 vs Hemin group；○P＜0.01 vs LY group.

eration 1.18±0.07 0.28±0.04 Ischemia 0.90±0.01＊ 0.46±0.02＊Hemin 1.02±0.07△△ 1.03±0.00△△LY 0.47±0.02△△ 0.44±0.03 Hemin＋LY 0.80±0.05△＃○ 0.89±0.05 b mRNA Sham op Group Expression of Akt mRNA Expression of Ng△△○

3 討 論

腦血管病具有發病率高、致殘率高、死亡率高和復發率高的特點，是老年人致死和致殘的重要原因。選擇有效靶點、改善缺血部位對缺血缺氧的耐受性、延長缺血組織和細胞發生不可逆損傷前的時間是目前治療缺血性腦血管病亟需解決的問題。

Ngb是2000年由德國科學家Burmester等［5］首先報道的、主要存在于脊椎動物腦內的一種新的攜氧珠蛋白，其與氧具有很高的親和力，并可以與氧可逆地結合，協助氧透過血腦屏障，增加代謝活躍的神經組織的氧供。在腦缺血缺氧、氧化應激和毒物損傷等病理情況下，Ngb的表達均有不同程度的增加。Ngb神經保護作用的確切機制尚不清楚，研究［6－9］發現：Hgb可能通過儲存氧和協助氧在細胞內向線粒體擴散、清除活性氧自由基和氮自由基及作為信號轉導中的調節子調節一個G－蛋白偶聯的信號轉導通路這3條途徑發揮作用。

本實驗結果顯示：在缺血前腹腔注射Hemin可上調大鼠腦組織中Ngb mRNA表達水平，同時Hemin組動物腦缺血后神經功能評分、腦梗死體積均較缺血組有明顯改善，進一步證實了Ngb對局灶性腦缺血大鼠的神經保護作用，而且Hemin能誘導Ngb表達增加從而減輕腦損傷。Hemin調控Ngb表達的機制尚不十分清楚，可能由可溶性鳥氨酸環化酶－蛋白激酶G通路介導［2］，但是否還存在其他機制有待于進一步研究。

PI3K／Akt信號途徑是腦缺血后與細胞損傷有關的重要的信號轉導通路，參與了腦缺血的病理過程，且與腦缺血損傷程度有關。多種神經營養因子通過激活PI3K／Akt信號通路抑制細胞凋亡，發揮腦保護作用［10］。PI3K是細胞內重要的信號轉導分子，激活后在質膜上產生第二信使PIP3，進一步引起信號蛋白Akt活化。活化的Akt通過磷酸化作用激活或抑制其下游效應分子的激活，進而調節細胞的增殖、分化、凋亡和遷移等，故Akt作為PI3K下游的直接靶蛋白，可反映PI3K／Akt信號通路的活性變化。LY294002是目前應用較廣泛的PI3K／Akt特異性抑制劑，通過特異性抑制PI3K p110亞單位的催化活性，阻礙下游底物PIP3的產生，使該通路處于失活狀態。

本實驗結果顯示：栓塞前給予特異性PI3K／Akt通路阻斷劑LY294002不僅增大了大鼠腦梗死體積、加重了神經功能缺損，而且抑制了Akt mRNA表達水平，但Ngb的表達與缺血組比較無差異；而在Ngb誘導劑Hemin的干預下，Akt mRNA的表達和Ngb均升高，大鼠腦組織損傷亦同時減輕，從而推斷腦梗死大鼠Ngb可能通過激活PI3K／Akt信號通路發揮腦保護作用。缺血組大鼠腦組織Akt mRNA表達較假手術組降低，與缺血后Ngb的變化趨勢不同，這與Zhao等［11］的報道一致，考慮與腦梗死24h缺血半暗帶內PI3K／Akt細胞信號幾乎衰竭及其促細胞存活生物學效應減弱有關，亦提示PI3K／Akt信號通路參與了腦梗死大鼠腦組織損傷過程。LY294002通過競爭性結合PI3K的ATP結合位點，阻斷PIP3的產生，進而抑制Akt的磷酸化以抑制PI3K／Akt信號通路的活性，理論上對Akt mRNA表達水平干預作用甚小。本實驗結果與張繼紅等［12］和朱建峰等［13］的研究結果一致，考慮可能與實驗條件、樣本量和反饋調節機制等有關。本研究僅從基因水平對Ngb的腦保護作用機制進行了初步探討，證實了PI3K／Akt通路可能介導了腦缺血后Ngb的神經保護作用，但尚需進一步從蛋白水平進行驗證。

［1］Yu Z，Liu N，Liu J，et al.Neuroglobin，a novel target for endogenous neuro－protection against stroke and neurodegenerative disorders ［J］.Int J Mol Sci，2012，13 （6）：6995－7014.

［2］Zhu Y，Sun Y，Jin K，et al.Hemin induces neuroglobin expression in neural cells［J］.Blood，2002，100（7）：2494－2498.

［3］劉 娟，姚國恩，蔣曉江，等.氯化血紅素對大鼠局灶性腦缺血組織的作用探討 ［J］.第三軍醫大學學報，2006，28 （10）：1035－1037.

［4］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84－91.

［5］Burmester T，Weich B，Reinhardt S，et al.A vertebrate globin expressed in the brain ［J］. Nature，2000，407 （6803）：520－523.

［6］Hota KB，Hota SK，Srivastava RB，et al.Neuroglobin regulates hypoxic response of neuronal cells through Hif－1α and Nrf2－mediated mechanism ［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2012，32 （6）：1046－1060.

［7］De Marinis E， Ascenzi P， Pellegrini M，et al.17βestradiol－－a new modulator of neuroglobin levels in neurons：role in neuroprotection against H2O2－induced toxicity ［J］.Neurosignals，2010，18 （4）：223－235.

［8］Watanabe S，Takahashi N，Uchida H，et al. Human neuroglobin functions as an oxidative stress－responsive sensor for neuroprotection ［J］. J Biol Chem， 2012，287 （36）：30128－30138.

［9］Li RC，Morris MW，Lee SK，et al.Neuroglobin protects PC12cells against oxidative stress ［J］.Brain Res，2008，1190 （3）：159－166.

［10］Nayak GH，Prentice HM， Milton SL. Neuroprotective signaling pathways are modulated by adenosine in the anoxia tolerant turtle ［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2011，31 （2）：467－475.

［11］Zhao H，Shimohata T，Wang JQ，et al.Akt contributes to neuroprotection by hypothermia against cerebral ischemia in Rats［J］.Neuroscience，2005，25 （42）：9794－9806.

［12］張繼紅，王 紅，任立群，等.血管生成素2經PI3K／Akt途徑對HCT－8細胞增殖的促進作用 ［J］.吉林大學學報：醫學版，2011，37 （6）：1057－1061.

［13］朱建峰，秦 儉，趙 倩，等.重組人促紅細胞生成素對缺血后處理大鼠心臟保護作用及對PI3K／Akt信號通路的影響 ［J］.重慶醫科大學學報，2011，36（7）：822－825.

Expression of neuroglobin in brain tissue of rats with cerebral infarction and its neuroprotective mechanisms

ZHANG Bei，LI Ya－jun，ZHANG Shi－jun，REN Hui－yun，WANG Min－juan，GUO Chang－jiang
（Department of Neurology，Affiliated Hospital，Xi’an Medical University，Xi’an 710077，China）

ObjectiveTo observe the expression of neuroglobin （Ngb）in brain tissue of rats with cerebral infarction and its effect on PI3－K／Akt signaling pathway，and to study their effects on cerebral ischemic injury and the possible mechanisms of the neuroprotective effect of Ngb.Methods60SD rats were randomly divided into sham operation group，ischemia group，and Hemin group，LY group，and Hemin＋LY group，and there were 12rats in each group.Cerebral infarction models were established by middle cerebral artery thread embolism method.All rats were sacrificed 24hafter operation for neurological evaluation and detection of cerebral infarction volume，and the expression levels of Ngb and Akt mRNA were detected by RT－PCR.ResultsThere was not any area unstained by triphenyltetrazolium chloride and any neurologic impairment found in rats in sham operation group.Compared with ischemia group，the expression levels of Ngb and Akt mRNA in Hemin group were increased significantly （P＜0.01），with better neurological function （P＜0.05）and less volume of cerebral infarction （P＜0.01）.The volume of cerebral infarction （P＜0.01）and the neurological impairments（P＜0.05）in LY group were increased，and the expression level of Akt mRNA in LY group was lower（P＜0.01）than that in ischemia group，and there was no significant difference in the expression of Ngb（P＞0.05）.The cerebral tissue damage in Hemin＋LY group was aggrevated，and the expression level of Akt mRNA was decreased（P＜0.01），while the level of Ngb mRNA was not inhibited by LY294002（P＞0.05）compared with Hemin group.ConclusionNgb can reduce the volume of cerebral infarction and improve neurological function after focal cerebral ischemia in rats and its neuroprotective effect may be realized by activating PI3－K／Akt signaling pathway.

neuroglobin；phosphoinositide－3kinase／serine－threonine kinase；cerebral infarction

R743.33

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1114－05

2012－07－26

陜西省自然科學基金資助課題 （2010JM4054）；陜西省教育廳科研基金資助課題 （09JK713）

張 蓓 （1980－），女，山東省濟寧市人，主治醫師，講師，在讀醫學博士，主要從事腦血管病發病機制的研究。

李亞軍 （Tel：029－84277893，E－mail：liyajun9＠hotmail.com）