誘導性多能干細胞技術的研究進展

李姝汶(綜述)，郭紅宇，王志平(審校)

(1.蘭州大學第二臨床醫學院，蘭州730107;2.蘭州大學第二醫院產科，蘭州730107;3.蘭州大學第二醫院泌尿外科，蘭州730107)

誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPS)是通過在分化的體細胞中表達特定的幾個轉錄因子，以誘導體細胞的重編程而獲得的可不斷自我更新且具有多向分化潛能的細胞。由于其在研究疾病機制，藥物篩選以及疾病治療領域具有巨大的應用潛力，iPS技術的發現被列為“21世紀十大科技成就”之一，并迅速成為科學研究的新熱點。

1 多能誘導干細胞技術的發展

1.1 轉錄因子的選擇 2006年，Takahashi等［1］通過導入反轉錄病毒異位表達 Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4因子誘導鼠成纖維細胞轉化為多能干細胞狀態，第一次建立鼠類 iPS細胞系。此后，Yu等［2］和Takahashi等［3］也運用類似方法成功誘導人類iPS細胞。自此，iPS細胞技術在短短幾年內就被廣泛研究并獲得了快速的發展。

最初研究者所使用的轉錄因子是Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4，c-Myc的致癌性使這種技術應用于臨床存在很高的風險。無c-Myc的iPS成功建系表明Myc基因在人和鼠的基因重組中并非必要，改進后重編程的效率大大降低［4-8］。2008 年，Kim 等［9］發現成鼠神經干細胞高表達內源性Sox2和 c-Myc，只需導入Oct4聯合Klf4或c-Myc兩個轉錄因子就可以成功誘導出小鼠iPS細胞，說明在誘導iPS細胞時，結合高表達的內源轉錄因子可以減少外源轉錄因子的使用數量，這大大降低了外源轉錄因子可能帶來的風險。最近，Kim 等［10］首次證明了只使用一種轉錄因子Oct3/4即可成功誘導iPS細胞，但其效率很低。

1.2 載體的發展 重編程的誘導是將外源轉錄因子導入目的細胞，啟動內源轉錄因子的表達，重編程的維持是依靠內源性因子。目前使用的載體主要為反轉錄病毒，而反轉錄病毒或慢病毒載體攜帶目的基因整合至宿主基因組能夠確保重編程所需目的蛋白高效集中地表達，可能導致細胞產生插入突變或引發致癌基因的表達。因此，科學家也在積極開發無需整合的基因載體來誘導重編程，如腺病毒［11］和質粒［12］。

減少載體數量也能夠降低整合造成的致癌概率。Carey等［13］用含有2A縮氨酸遺傳代碼的DNA將4種重組基因串聯起來的方法獲得了有能力表達多個基因的多順反子性的慢病毒，將病毒載體數目從4個減少到1個，從而極大地簡化了iPS的誘導。這項重要進展的推廣面臨著幾個限制因素:①需要對蛋白進行多次復雜的提純;②減慢了重組動力;③重組效率低。

1.3 iPS細胞技術派生方法學的發展 為了消除外源轉錄因子重新活化而帶來的危險性，很多研究者嘗試在外源轉錄基因發生基因沉默后將其從基因組中去除。Cre/LoxP重組體系能夠成功切除已經轉染的目標細胞內的整合基因，去除復雜的轉座子是一個費力復雜的過程，即使成功了，這個策略也會留下導致載體序列發生突變的潛在后遺癥［14］。近期有在鼠細胞中發現轉基因無痕剪切的報道，這項技術應用了PB轉座子系統，這項技術在人類細胞中的進展十分緩慢［15］。

近期有研究者在重編程過程中加入一些小分子干涉RNAs(siRNAs)或微小RNAs(miRNAs)，發現這些小分子能夠取代一些重編程因子或提高重編程的速度和效率，可能產生更加安全的iPS細胞。Huangfu等［16-17］發現組氨酸脫乙酰酶抑制劑丙戊酸能夠提高重組效率達100倍并能促進僅有Oct4和Sox2誘導的重編程。Zhao等［18］表明，p53 siRNAs大大提高了經典Yamanaka 4因子體系的誘導效率。Ichida等［19］最近發現一種小分子抑制劑轉化生長因子β信號可以代替Sox2，誘使Nanog表達來啟動重編程。iPS細胞中被上調的miRNA也可能對重編程有促進或抑制作用［20］。總之，以iPS細胞派生的方法學的迅速發展，改善了現有的iPS技術，這些分子水平基因重排的促進作用的具體機制仍不明確。

1.4 原始細胞的選擇 早期研究者使用成纖維細胞進行重編程，近期其他研究小組也用其他來源于3種不同胚層的體細胞進行了嘗試，包括B淋巴細胞、黑色素細胞、角蛋白細胞、間質細胞、外周血細胞、脂肪干細胞等［9，21-24］。

Kim等［25］報道了人胎兒神經干細胞能夠只用Oct4因子就能實現重編程。鑒于獲取這種細胞需要侵入性的手術，目前不能作為誘導iPS細胞的穩定來源。神經干細胞可以作為更好且更加簡便的平臺來獲取iPS細胞以及動物疾病模型，這為研究iPS細胞移植、人類疾病機制以及藥物研發都提供了很好的工具。

Utikal等［26］利用人初級黑色素細胞作為起始細胞進行重編程，正如皮膚成纖維細胞和角質細胞一樣，黑色素細胞也是在特殊條件下經皮膚活檢組織培養體外而來。這種細胞有高水平的Sox2因子表達，因此只需要另外3種因子(Oct4、Klf4、c-MYC)來誘導重編程，因為該研究所用的黑色素細胞的供體年齡并不明確，因此關于成人的黑色素細胞重編程的效率和速度并不清楚。盡管如此，利用黑色素細胞通過較少的細胞因子以及非集成化的技術為提高獲得iPS細胞的安全性提供了一個很好的機會。

近期有兩篇文章報道了利用臍帶血細胞成功誘導iPS細胞。Giorgetti等［27］僅利用Oct4和Sox2兩種轉錄因子將從臍帶血細胞中分離的CD133+細胞誘導成iPS細胞，利用低溫冷藏了5年的臍帶血所分離的細胞也誘導成功。Haase等［28］利用臍帶血來源的內皮細胞外加 Thomson 4因子(Oct4、Sox2、Nanog、Lin28)誘導出iPS細胞。臍帶血含有包括造血干細胞在內的許多不同種類的細胞，因此要用臍帶血細胞作為iPS細胞的來源就需要患者出生時儲存臍帶血。目前科學界不明確臍帶血究竟能凍存多久還能保持其重編程的能力，所以這項技術應用前應對凍存了幾十年的臍帶血進行重編程能力測定。

靶細胞不同，重組的概率就不同，如造血干細胞重組效率高于末端分化的B細胞和T細胞［29］。不同來源的細胞具有不同的分化性質。一項研究發現來自肝細胞的iPS細胞更傾向于分化為畸胎瘤而非神經元細胞及其前體［30］。總之，不同類型細胞的重組效率、動力學和重組分化潛能都有很大差別，實際應用可能導致療效的差異。

2 多能誘導干細胞在醫學研究領域中的新進展

iPS細胞與胚胎干細胞在基因表達、DNA甲基化、胚狀體、活嵌合體方面都完全相同，具有生成所有胚層細胞并繼續分化為多種成體細胞的能力。因此，這項技術最有潛力的應用前景是產生疾病或個體特異的多能干細胞，用于研究組織功能、篩選新藥和移植治療遺傳或退行性疾病。

目前疾病特異性iPS細胞的培養也已經在其他十余種基因疾病中實現，包括帕金森病、1型糖尿病、肌營養不良癥、腺苷脫氨酶缺乏有關嚴重聯合免疫缺陷、Gaucher病Ⅲ型、亨廷頓舞蹈癥、唐氏綜合征、自毀容貌癥［31］。這些細胞系不僅可以作為外模型用來研究相應疾病，同時也可以作為細胞替換療法的一種潛在的細胞來源。

2.1 血液遺傳病 2009年，Ye等［32］用包含4個轉錄因子基因(Oct4、Sox2、Klf4、cMyc)的反轉錄病毒載體轉染β珠蛋白障礙性貧血患者的皮膚誘導成纖維細胞重編程為iPS，發現這些iPS細胞可以分化成造血干細胞并進一步生成血細胞，表明使用iPS技術進行早期細胞治療能夠為珠蛋白生成障礙性貧血胎兒圍生期治療提供新的方法。

2.2 肝臟疾病 研究發現成纖維細胞來源的iPS細胞可以恢復酵素水解酶缺陷型小鼠的肝功能，證明了iPS細胞分化而來的肝細胞不僅能夠重新回到肝臟，且可修復肝功能的損壞［31］。這項研究加深了研究者對體內情況下iPS細胞分化為肝細胞潛力的了解以及用患者肝細胞建立體外疾病模型的應用。

2.3 心血管疾病 另有實驗表明iPS細胞可以分化為組成心血管的主要細胞類型，包括平滑肌細胞、內皮細胞、血管壁細胞以及心肌細胞［33-35］。通過人的胚胎干細胞和iPS細胞分化而來的心肌細胞已被用于藥物毒性測試，如藥物引起Q-T間期延長導致的突發性心跳停止，而這恰好是制藥公司最為關注的安全問題［36］。

2.4 神經退行性疾病 Dimos等［37］成功地從一個患有家族肌萎縮側索硬化癥且伴有超氧化物歧化酶1變異的老年患者身上獲取體細胞并誘導成iPS細胞，這些iPS細胞分化為帶有典型標志物Hb9和胰島素基因增強結合蛋白1的運動神經元細胞。雖然脊髓性肌萎縮癥和肌萎縮側索硬化癥都屬于運動神經元神經退行性疾病，但只有脊髓性肌萎縮癥患者的iPS細胞所分化而成的運動神經元有相應癥狀。這可能是因為肌萎縮側索硬化癥基本都是中年以后發病，而脊髓性肌萎縮癥基本都是兒童期發病。此外，也可能是由于神經退行性疾病模型所采用的iPS細胞是來自于具有常染色體隱性遺傳脊髓性肌萎縮癥和家族性自主神經異常的患者。

2010年，Amoh等［38］研究發現毛囊誘導干細胞可以形成神經元和其他細胞類型，移植的毛囊干細胞促進周圍神經功能恢復和脊髓受傷，因此成人毛囊干細胞的治療應用尤其是對神經系統疾病的治療，有了潛在的臨床實用性。這些研究為神經退行性疾病機制以及藥物的研發開辟了新的道路。

3 問題與展望

由于iPS細胞自身的特性，既可用于研究組織功能和篩選新藥，也可用于移植治療遺傳或退行性疾病，不僅避免了免疫排斥及倫理問題，還可以產生新的治療方法。iPS細胞技術應用在臨床實踐前，仍然面臨著一些重要的挑戰:①iPS細胞誘導方法仍存在諸多不足，尚待改進。以經典的反轉錄病毒介導重排的人類iPS細胞生成效率低，僅有0.001%～0.01%;用于重組病毒載體的重組基因是已知的致癌基因，特別是c-Myc、Oct4和Klf4產生的iPS細胞不可能安全地被用于臨床。一些新技術的發展，包括無病毒整合的重組質粒或直接重組等蛋白質技術以及化學或包括蛋白在內的小分子誘導的辦法，就有可能解決這些問題。②iPS細胞自身安全性有待提高，尚未達到“臨床級別”。同其他來源的干細胞一樣，iPS細胞自身也具有潛在危險性，如畸胎瘤的形成、異常重編程等。因此，iPS細胞的任何臨床試驗和治療應用前應首先確定統一的鑒定iPS安全性的標準，并在適當的動物模型上經過嚴格的測試。③未來進行患者自體特異性iPS細胞的生產以及臨床治療時要慎重考慮選擇哪一種類型的細胞進行重編程。從患者身上分離進行重編程的理想的細胞來源應符合以下標準:容易取得且手術風險小;獲取量要足夠大;擁有較高的重編程效率;重編程后的iPS細胞具有較快的分裂速度。為確保iPS細胞技術在臨床前研究及臨床應用，還應開發體內追蹤細胞命運軌跡的新技術，以探索iPS細胞的療效及后期影響。④在倫理方面。iPS細胞雖然避免了從人類胎盤獲取的爭議，但是并不代表在道德層面不受質疑。iPS細胞可以從活體捐贈者身體組織中取得，對捐贈者的跟蹤接觸可能接觸到道德和法律底線，用這種方式研究取得成果的發表也可能觸犯捐贈者的健康和權利。

盡管利用iPS細胞技術應用于臨床治療面臨著很多困難，一旦實現可行、安全、高效、無病毒、無轉基因的自體iPS細胞技術這一研究領域的最終目標，必將給醫學研究及多種疾病治療帶來深遠的影響。

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