雛番鴨細(xì)小病毒病研究進(jìn)展

董嘉文 李林林 孫敏華（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室，廣州， 510640）

雛番鴨細(xì)小病毒病是由雛番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovirus,MDPV）引起的雛番鴨以喘氣、腹瀉、腳發(fā)軟及進(jìn)行性消瘦為主要癥狀的一種急性、敗血性傳染病，其特點(diǎn)是傳染性強(qiáng)和死亡率高[1-2]。該病主要發(fā)生于3周齡以內(nèi)的雛番鴨，因此又稱雛番鴨“三周病”；發(fā)病率和死亡率可達(dá)40%以上，是目前番鴨飼養(yǎng)業(yè)中危害最嚴(yán)重的傳染病之一，嚴(yán)重影響?zhàn)B鴨業(yè)的發(fā)展。我國(guó)是發(fā)現(xiàn)和研究番鴨細(xì)小病毒最早的國(guó)家，1985年以來(lái)，在我國(guó)福建等南方多省均出現(xiàn)該病[3]，而后，法國(guó)、美國(guó)和日本等地也相繼報(bào)道本病的流行。1988年，程由銓等首次分離并鑒定該病的病原為番鴨細(xì)小病毒[4]。

1 病毒特征

1.1 形態(tài)特征

MDPV病毒粒子呈球形或六角形，二十面體，無(wú)囊膜，直徑大小為22～25 nm。有實(shí)心和空心2種顆粒形態(tài)，空心內(nèi)直徑為15 nm，衣殼厚度為5 nm，殼粒數(shù)32，病毒衣殼的殼粒排列規(guī)則呈管狀結(jié)構(gòu)，殼粒直徑為3～4 nm。在氯化銫中，實(shí)心和空心病毒粒子浮密度分別為 1.39～1.42 g/cm3和 1.38 g/cm3[5-6]。

1.2 理化特性

MDPV 對(duì) pH3.0、pH5.0 和 60℃1 h 均有抵抗力；對(duì)酸、氯仿、乙醚和胰酶不敏感，但對(duì)紫外線輻射敏感。對(duì)雞、麻鴨、番鴨、鵝、豬、牛、兔、豚鼠、綿羊和“O”型紅細(xì)胞無(wú)凝集作用。

1.3 培養(yǎng)特性

番鴨細(xì)小病毒初代分離只能用番鴨胚，而在其他胚中不能增殖，在鴨胚傳代適應(yīng)后可以在鵝胚上生長(zhǎng)增殖并引起特征性病變。MDPV也能在番鴨胚和鵝胚的成纖維細(xì)胞以及番鴨胚腎細(xì)胞上增殖，不能在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)、豬腎傳代細(xì)胞(PK15)、地鼠腎傳代細(xì)胞(BHK21)和綠猴腎傳代細(xì)胞(Vero)上增殖。

2 流行病學(xué)和臨床癥狀

2.1 流行病學(xué)

雛番鴨是惟一自然感染發(fā)病的動(dòng)物，發(fā)病率和死亡率與日齡關(guān)系密切，日齡愈小發(fā)病率和死亡率愈高，3周齡以內(nèi)的雛番鴨發(fā)病率為20%～60%，病死率為20%～40%不等。30日齡以上的番鴨也可發(fā)病，但發(fā)病率和死亡率較低，病鴨往往成為僵鴨。病鴨通過(guò)排泄物特別是通過(guò)糞便排出大量病毒，污染飼料、飲水、用具、人員和周圍環(huán)境造成傳播。如果病鴨的排泄物污染種蛋外殼，則引起孵房?jī)?nèi)污染，使出殼的雛番鴨成批發(fā)病。本病發(fā)生無(wú)明顯季節(jié)性，但是由于冬春氣溫低，育雛室空氣流通不暢，空氣中氨和二氧化碳濃度較高，故發(fā)病率和死亡率較高。而在夏季發(fā)病率低，通風(fēng)較好的情況下，發(fā)病率一般為20%～30%。

2.2 臨床癥狀

本病的潛伏期4～9d，病程2～7d，病程長(zhǎng)短與發(fā)病日齡密切相關(guān)。根據(jù)病程長(zhǎng)短可分為最急性、急性和亞急性兩種類型。

最急性:多發(fā)生于6d以內(nèi)的病雛，病勢(shì)兇猛，病程很短，只有數(shù)小時(shí)，多數(shù)病例不表現(xiàn)前驅(qū)癥狀即衰竭，倒地死亡，此型的病雛喙短，偶見(jiàn)羽毛直立、蓬松。臨死時(shí)兩腳呈游泳狀，頭頸向一側(cè)扭曲。該型發(fā)病率低，占整個(gè)病雛數(shù)的4%～6%。

急性型:主要見(jiàn)于7～14日齡雛番鴨，主要表現(xiàn)為精神委頓，羽毛蓬松，兩翅下垂，尾端向下彎曲，兩腳無(wú)力，懶于走動(dòng)，厭食，離群；有不同程度腹瀉，排出灰白或淡綠色稀糞，并黏附于肛門周圍；呼吸困難，喙端發(fā)紺，后期常蹲伏，張口呼吸。病程一般為2～4d，瀕死前兩肢麻痹，倒地抽搐，衰竭死亡。

亞急性型:多見(jiàn)于發(fā)病日齡較大的雛鴨，主要表現(xiàn)為精神委頓，喜蹲伏，兩腳無(wú)力，行走緩慢，排黃綠色或灰白色稀糞，并黏附于肛門周圍。病程5～7d，病死率低，大部分病愈鴨頸部、尾部脫毛，嘴變短，生長(zhǎng)發(fā)育受阻，成為僵鴨。

3 病理學(xué)變化

3.1 剖檢變化

最急性型由于病程短，發(fā)病急，病變不明顯，僅在腸道出現(xiàn)急性卡他性炎癥，并伴有腸黏膜出血，其他內(nèi)臟無(wú)明顯病變。

急性型病變較典型，呈全身敗血現(xiàn)象。心臟變圓，心壁松弛，尤以左心室病變明顯；肝臟稍腫大，少數(shù)有明顯壞死灶。膽囊顯著腫大。膽囊充盈，腎和脾稍腫大，胰腺充血或局灶性出血，表面散布針尖大灰白色病灶。特征性病變?cè)谀c道，十二指腸前段有膽汁滲出，十二指腸后段及空腸前段呈急性卡他性炎癥，有大量出血點(diǎn)密布于黏膜表面。空腸中后段和回腸前段的黏膜有不同程度脫落。回腸后段可見(jiàn)大量炎性滲出物，或內(nèi)混有脫落的腸黏膜，偶見(jiàn)形成假性“栓子”[7]。

3.2 組織學(xué)變化

心肌束間有少許紅細(xì)胞滲出，血管擴(kuò)張、充血；腦神經(jīng)細(xì)胞輕度變性，膠質(zhì)細(xì)胞輕度增生；肝小葉間血管擴(kuò)張、充血，細(xì)胞局灶性脂肪變性；肺內(nèi)血管充血，大部分肺泡壁增寬、充血及瘀血，肺泡腔減少，少數(shù)肺泡囊擴(kuò)張；腎近曲小管變化較大，表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞變性，管腔內(nèi)紅染，分泌物積蓄；胰腺呈散在灶性胰腺泡壞死。

4 MDPV基因組結(jié)構(gòu)

MDPV屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，其基因組為單鏈線性DNA，MDPV基因組全長(zhǎng)約5.1kb，包含兩個(gè)主要開(kāi)放閱讀框架(ORF)，兩個(gè)ORF位于同一讀碼框內(nèi)[6]。左側(cè)ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS,由NS基因編碼的蛋白主要參與病毒DNA的復(fù)制及調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[8]。NS1蛋白可能參與病毒對(duì)細(xì)胞的毒性作用、病毒復(fù)制及基因表達(dá)。NS2蛋白能促進(jìn)NS1蛋白對(duì)細(xì)胞的毒性作用[9-10]。現(xiàn)已證明NS1蛋白具有與ATP結(jié)合、ATPase活性、解旋酶活性等功能[11]。NS2蛋白還可能與病毒DNA和蛋白有效合成以及病毒增殖有關(guān)。右側(cè)ORF編碼病毒的三種結(jié)構(gòu)蛋白:VP1、VP2、VP3。研究表明VP2和VP3為主要結(jié)構(gòu)蛋白，其中VP3是主要衣殼蛋白，約占總蛋白的80%，它含有MDPV主要抗原決定簇成分，是病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的主要蛋白抗原[12]。

MDPV在病毒大小、理化特性、形態(tài)結(jié)構(gòu)、核酸類型及免疫學(xué)特性等方面與鵝細(xì)小病毒（GPV）很接近[6,13]，但兩者在致病性上存在較大差異。MDPV只能感染番鴨及番鴨源細(xì)胞，而GPV既能感染鵝，又可以感染番鴨及其體外培養(yǎng)細(xì)胞。因此，在MDPV的研究上，既要關(guān)注MDPV病毒本身的病原學(xué)和分子生物學(xué)及疫苗研究，也要關(guān)注MDPV與GPV之間的鑒別診斷和基因序列特點(diǎn)，以進(jìn)一步探討病毒的致病機(jī)理及防治關(guān)鍵。

5 MDPV的檢測(cè)和診斷

5.1 病原學(xué)診斷

病毒分離主要參照程由銓等[4]的方法，將處理好的病料組織上清液，尿囊腔接種11～13d番鴨胚，觀察病變，并取24h后死亡的胚液,膠乳凝聚試驗(yàn)呈陽(yáng)性者判定為陽(yáng)性。

MDPV病原學(xué)的檢測(cè)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室常用分子生物學(xué)方法，Jestin V等[14]最先建立了PCR檢測(cè)MDPV核酸的方法。婁高明等[15]也報(bào)道了PCR檢測(cè)方法，但該法特異性不強(qiáng)，也能擴(kuò)增出鵝細(xì)小病毒（GPV）。因番鴨細(xì)小病毒和鵝細(xì)小病毒兩者在核酸類型和基因組結(jié)構(gòu)等方面很相似，基因組序列相似性達(dá)81.9%[16]，此后，研究者們更關(guān)注于鑒別診斷2種病毒的分子生物學(xué)方法。通過(guò)比對(duì)Genbank上已發(fā)表的MDPV和GPV核苷酸序列，根據(jù)不同區(qū)段設(shè)計(jì)引物，胡奇林等[17]設(shè)計(jì)并合成了1對(duì)通用引物(PC1/PC2)和1對(duì)MPV特異引物(PS1/PS2)，準(zhǔn)確、快速鑒別番鴨和鵝細(xì)小病毒。婁華等[18]、劉家森等[19]、季艷菊等[20]、鮮思美等[21]及宋永峰等[22]都報(bào)道建立了可用于鑒別診斷GPV和MDPV的PCR方法。另外，Sirivan等[23]應(yīng)用PCR結(jié)合限制酶切片段分析更加準(zhǔn)確特異地鑒別診斷MDPV和GPV。Gall-Recule等[24]報(bào)道建立了核酸探針檢測(cè)MDPV核酸的方法可用于MPV的快速診斷，用地高辛標(biāo)記作探針，能檢出MDPV DNA的最低量為3fg，但該法與小鵝瘟病毒DNA有比較低的交叉反應(yīng)。Ji等[25]針對(duì)MDPV VP3基因設(shè)計(jì)了LAMP檢測(cè)引物，建立的檢測(cè)方法具有很好的特異性和靈敏性，能鑒別檢測(cè)MDPV和GPV，并且所需時(shí)間短，儀器簡(jiǎn)單。

5.2 MDPV 血清學(xué)診斷

MDPV常用的血清學(xué)診斷方法包括瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）、膠乳凝集試驗(yàn)(LPA)、中和試驗(yàn)（NT）、免疫熒光抗體試驗(yàn)(FA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。

5.2.1 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）

婁華等[26]將分離的番鴨細(xì)小病毒通過(guò)正常發(fā)育的番胚傳代，分別取不同代次的病毒尿囊液經(jīng)氯仿、聚乙二醇濃縮處理后制成不同代次的抗原。該抗原與抗番鴨細(xì)小病毒抗血清在含有20g/L PEG6000的瓊脂平板上作用，可見(jiàn)有明顯的沉淀線。此法在流行病學(xué)調(diào)查及疫苗免疫檢測(cè)方面具有重要的參考意義。

5.2.2 中和試驗(yàn)（NT）

程由銓[4]用固定單抗稀釋病毒方法，即不同稀釋度的病毒與等量的1:10稀釋的腹水單抗充分混合后，置37℃CO2培養(yǎng)箱作用60min，接種細(xì)胞或番鴨胚，37℃培養(yǎng)，觀察至第10d。按Karber氏法計(jì)算中和指數(shù)。

5.2.3 膠乳凝集試驗(yàn)(LPA)

胡奇林等[27]、程曉霞[28]利用單克隆抗體建立了膠乳凝集試驗(yàn)(LPA)、免疫熒光抗體試驗(yàn)(FA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)3種檢測(cè)MPV抗原的方法，并將這3種方法與病毒分離（VI）進(jìn)行了比較，結(jié)果上述4種方法均可用于診斷番鴨細(xì)小病毒病，任何兩種方法之間的符合率均在82.1%以上，LPA方法快速、簡(jiǎn)便及直觀，是診斷番鴨細(xì)小病毒病的實(shí)用方法。程曉霞[29]還比較了膠乳凝集抑制試驗(yàn)（LPAI）和血清中和試驗(yàn)（SN）檢測(cè)番鴨細(xì)小病毒抗體效價(jià)，結(jié)果SN雖比LPAI敏感性高，但操作繁雜、費(fèi)時(shí)，LPAI更適用臨床。

5.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

黎敏等[30]建立了檢測(cè)番鴨細(xì)小病毒抗體的間接ELISA方法，與DRV和DHV無(wú)交叉反應(yīng)，但與GPV陽(yáng)性血清有一定的交叉反應(yīng)。批內(nèi)批間重復(fù)性好，且與血清中和試驗(yàn)的符合率為98%。Zhang等[31]用GPV Ep22株VP3蛋白的原核表達(dá)產(chǎn)物作包被抗原建立ELISA方法，可特異性檢測(cè)出MDPV和GPV，特異性和靈敏度分別為 91.8%、96.7%和 90.2%、95.2%。

6 MDPV的免疫和防制

番鴨細(xì)小病毒病的發(fā)生無(wú)季節(jié)性，主要通過(guò)消化道和呼吸道傳播，冬春季節(jié)氣溫低、空氣不暢通，發(fā)病率和死亡率較高。本病作為一種病毒病，重在預(yù)防，必須采取綜合防制措施。同時(shí)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，嚴(yán)格消毒制度，對(duì)種蛋、孵坊和育雛室要嚴(yán)格消毒。

6.1 被動(dòng)免疫

在本病流行鴨場(chǎng)或者區(qū)域，1日齡的雛番鴨皮下注射高免血清或卵黃抗體，可達(dá)到預(yù)防或控制本病的流行發(fā)生。每雛番鴨皮下注射0.5mL，其保護(hù)率可達(dá)95%左右；對(duì)已經(jīng)感染發(fā)病的雛番鴨群的同群雛番鴨，每只皮下注射 0.8～1.0mL，保護(hù)率可達(dá) 80%左右；對(duì)已感染發(fā)病早期的雛番鴨，每只皮下注射1.0～1.5mL，治愈率可達(dá) 50%左右[32]。

6.2 主動(dòng)免疫

應(yīng)用疫苗免疫種番鴨是預(yù)防本病最有效的方法。種番鴨在產(chǎn)蛋前15天左右用番鴨胚化種鴨弱毒苗進(jìn)行皮下或肌肉注射。在免疫12天后至4個(gè)月內(nèi)，番鴨群所產(chǎn)蛋孵化的雛番鴨群能抵抗人工及自然病毒的感染。種番鴨免疫4個(gè)月以后，雛番鴨的保護(hù)率下降，種番鴨必須再次進(jìn)行免疫，以達(dá)到較佳的保護(hù)率。

未經(jīng)免疫的種番鴨群，或種番鴨群免疫4個(gè)月以上的所產(chǎn)蛋孵化的雛番鴨群，在出殼48h內(nèi)應(yīng)用番鴨胚化雛番鴨弱毒疫苗或細(xì)胞弱毒疫苗進(jìn)行免疫，保護(hù)率可達(dá)95%左右。在已感染的雛番鴨群作緊急預(yù)防，保護(hù)率達(dá)50%左右。已被感染發(fā)病的雛番鴨進(jìn)行免疫注射無(wú)明顯防治效果[32]。

7 MDPV疫苗的研制及發(fā)展

1992年，程由銓等[33]首次選育成符合制備減毒活疫苗用的弱毒疫苗株MDPV-P1，用該疫苗免疫1日齡番鴨，7天后全部出現(xiàn)抗體，弱毒株具有良好的免疫原性和遺傳穩(wěn)定性。將MDPV-P1弱毒苗免疫1日齡番鴨后7天攻毒，能夠保護(hù)免疫鴨免受強(qiáng)毒攻擊，免疫接種1.8億多羽雛番鴨，未見(jiàn)不良反應(yīng)，該疫苗安全、有效[34]。法國(guó)等地也使用弱毒疫苗和滅活疫苗進(jìn)行田間免疫[35-36]。陳少鶯等[37]試制了番鴨細(xì)小病毒和鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV）二聯(lián)弱毒細(xì)胞疫苗，結(jié)果該二聯(lián)苗對(duì)1日齡雛番鴨具有良好的安全性和遺傳穩(wěn)定性。婁華等[38]也研制了番鴨細(xì)小病毒的弱毒疫苗，經(jīng)在發(fā)病地區(qū)應(yīng)用，取得了較好的效果。王永坤等[39]研制的鵝胚化MPV單價(jià)疫苗和MDPV及GPV二聯(lián)活疫苗，在疫區(qū)應(yīng)用也有較好效果。

實(shí)際生產(chǎn)中，由于MDPV強(qiáng)毒的感染普遍存在，導(dǎo)致雛番鴨母源抗體水平相差較大，而目前我國(guó)MDPV弱毒疫苗的免疫多在雛番鴨1日齡時(shí)進(jìn)行，受母源抗體水平的影響和干擾，致使弱毒苗不能給雛番鴨提供完全保護(hù)，以致近年來(lái)國(guó)內(nèi)外常有番鴨細(xì)小病毒病發(fā)生的報(bào)道[40-41]，給生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失；同時(shí)，弱毒疫苗本身存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)，因此，迫切需要研究更安全有效的新型疫苗用于MDPV的防制。

在番鴨細(xì)小病毒的新型疫苗研究方面也有嘗試構(gòu)建核酸疫苗和亞單位疫苗的初步報(bào)道，Le Gall-Recule等[42]用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)MDPV的VP2和VP3蛋白，用表達(dá)的重組蛋白免疫3周齡番鴨后檢測(cè)到抗MDPV抗體的產(chǎn)生，并且檢測(cè)到的中和抗體滴度與用商品化滅活苗免疫番鴨后的結(jié)果接近。李雪梅等[43]構(gòu)建了鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒的核酸疫苗重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，檢測(cè)到表達(dá)產(chǎn)物具有反應(yīng)原性，為進(jìn)一步研制MPV基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。而活病毒載體疫苗僅提供MDPV主要免疫原性蛋白作為免疫原，其受MDPV母源抗體影響較低，具有生物安全性高等優(yōu)點(diǎn)，是未來(lái)新型疫苗發(fā)展的主要方向之一。

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