微小核糖核酸在參與缺血/再灌注過程中的研究進展

黃鄧君(綜述)，魏煜程，沈 毅(審校)

(青島大學醫學院附屬醫院胸外科，山東青島 266000)

微小核糖核酸(micro-ribonucleic acid，miRNA)是一種5'端帶磷酸基團、3'端帶羥基，長度為18～25個核苷酸存在于真核生物中的非編碼調控RNA，現已證實miRNA通過與靶mRNA結合以及調節靶mRNA的蛋白質翻譯過程來調控基因的表達。既往已有關于miRNA與腫瘤之間的相關性研究，因缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，I/R)是器官移植術后的重要難題，故如今研究的重點已轉向miRNA參與I/R過程中細胞凋亡、增殖與分化以及炎性反應的研究上。現簡要介紹miRNA在參與I/R過程中的研究進展，以期在分子水平上為早期診斷及干預I/R提供理論依據。

1 miRNA概述

1.1 miRNA的發現 1993年Lee等［1］首次在秀麗隱桿線蟲發現 miR-lin-4，隨后科學家 Reinhart等［2］在線蟲中發現另外一種miR-let-7。目前在人類、動植物等物種中已有8000余種miRNA被發現，這些miRNA的序列在進化關系較近的物種間具有保守性，人類基因組中已確認的有800多種，參與生命過程中的一系列重要進程，包括早期胚胎發育、細胞增殖、細胞分化以及細胞凋亡［3-4］。

1.2 miRNA的形成及其作用機制 核酸酶Drosha在胞核內加工miRNA的初始轉錄產物(初miRNA)成為miRNA的前體［5］，miRNA的前體由60～90個核苷酸構成，呈莖環結構，細胞核內的miRNA前體由Ran-GTP酶以及其受體輸出蛋白-5轉運出細胞核進入細胞質中，并由胞質中的RNaseⅢ-Dicer酶剪切出成熟的雙鏈miRNA。通常情況下，雙鏈RNA中的一條單鏈會與核糖核蛋白形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，另一條鏈發生降解;當然也有一些miRNA雙鏈會分別與不同的核糖核蛋白結合。RISC通過miRNA的指導與靶mRNA結合從而剪切靶mRNA或者抑制靶mRNA的翻譯(兩種方式)來執行miRNA的基因沉默功能［6］。RISC與靶mRNA的結合若是部分互補的，則可抑制靶mRNA的翻譯;若其結合是完全互補的，則可降解靶mRNA。在植物中通常采用第一種方式，第二種方式通常在動物中發生。例如果蠅的let-7直接介導RISC剪切靶mRNA;而當與靶mRNA不完全互補結合時，調節基因的表達;線蟲中的1et-7與靶mRNA不完全配對結合后，抑制靶 mRNA 的翻譯［7］。Wu等［8］提出另外一種去腺苷酸化機制參與miRNA的基因調控。其依據是已知lin-28與miR-125b呈不完全互補方式結合，當把miR-125b轉入人類胚胎腎細胞293T后發現連接了lin-28的p-球蛋白mRNA明顯縮短，這種縮短與腺苷酸的清除有關。一個miRNA可調節數個甚至數百個不同的靶mRNA，而幾種不同的miRNA也可以聯合調控單一的靶mRNA，miRNA和靶mRNA組成了復雜的調節網絡系統［9］。

1.3 miRNA的命名 miRNA的命名遵循以下制訂的幾個原則［10-11］:①miRNA簡寫成為miR，根據被克隆出來的先后順序加上阿拉伯數字，比如miR-125;②將物種縮寫置于miR的前面，比如has-miR-125;③高度同源的miRNA在數字后面加上英文小寫字母以示區分，比如miR-125a和miR-125b;④根據由不同染色體上的DNA轉錄而成的具有相同成熟體序列的miRNA，在后面再加上阿拉伯數字，比如miR-125a-1和miR-125a-2;⑤由同一前體的兩個臂分別產生的miRNA，根據克隆實驗表達水平較低的miR后面加*，例如miR-125a和miR-125a*，或者命名miR-125-5p(表示從5'端的臂上加工而來);⑥在規則確定之前發現的miRNA保留原來的名字，如let-7等。

2 I/R與肺移植

肺移植是臨床上治療終末期肺病的唯一有效手段，目前臨床上已經成功實現單肺、雙肺以及心肺聯合移植。但是，肺移植術后出現I/R是無法避免的一個難題，也是導致手術失敗的主要原因之一。I/R對臟器造成的損傷機制極其復雜，包括缺血期損傷和再灌注期損傷;缺血期急性缺氧造成三磷酸腺苷的減少，進而導致細胞內離子紊亂和水解酶激活，造成組織損傷;再灌注過程中組織產生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，進而加重組織損傷。ROS是I/R中主要的損傷因子，它在再灌注期損傷中扮演著激活組織中炎性細胞，釋放白細胞介素、腫瘤干擾因子等一系列炎性因子，促進組織細胞凋亡，加重組織損傷的角色。肺移植術后早期有15%～20%的移植肺功能發生障礙，而初期發生移植肺功能障礙的主要原因是I/R，發生I/R后肺實質細胞出現凋亡，肺組織出現壞死，臨床表現為進行性低氧血癥、肺順應性減小等一系列肺功能障礙。I/R發生的病理生理貫穿于供肺的切取、保存及再灌注的整個過程。為此，人們進行了不懈努力，主要集中于對移植肺有保護作用的物理因素(缺血預處理，氧濃度，膽堿能抗炎通路)及藥物上。從分子水平上研究肺組織I/R發生機制研究甚少。I/R的發生、發展是多因素、多步驟的復雜過程。尋找發生肺組織I/R的分子機制，可為早期診斷及治療肺組織發生I/R提供理論基礎，甚至可為更深入地了解肺部疾病的發生機制提供研究靶點。

3 miRNA在基因表達中的調控作用

關于miRNA調節細胞增殖的研究有:Bantam是果蠅中一個能抑制細胞凋亡、促進細胞增殖的miRNA，它可抑制誘導果蠅細胞凋亡的Hid蛋白的表達，從而促進細胞增殖［12］;Chan 等［13］研究表明，miRNA-21在人類惡性膠質瘤中普遍表達，并且通過抑制miRNA-21的表達，惡性膠質瘤細胞數目減少，而且胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7活性增加了3倍，凋亡明顯升高。關于miRNA調節細胞凋亡的研究有:Cimmino等［14］發現 miRNA-15a和 miRNA-16-1通過調控Bcl-2蛋白的表達參與細胞的凋亡過程;Alex等［15］研究指出，ROS在缺氧環境下刺激缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)和血管內皮生長因子表達上調及缺氧誘導的多種miRNA上調。HIF-1屬于在細胞內氧濃度改變而引起的一系列反應中起關鍵調控作用的轉錄因子家族成員之一。在缺氧情況下HIF-1降解受阻，合成增多，結果是HIF-1水平上升，轉錄活性增強。同時指出在缺氧情況下，miR-210、miR-30b、miR-93、miR-181b 的表達水平發生改變，并證實它們是在缺氧情況下調節HIF-1表達的 miRNA。Ivan等［16］指出 miR-210等3種 miRNA在缺氧情況下會發生至少2倍的變化。

4 miRNA與炎性反應

I/R 的基本特征之一是炎性反應，已有多篇文獻報道miRNA與免疫、炎性反應之間的關系［17-20］。在實驗動物的肺組織中進行的研究有:Moschos等［21］用脂多糖建立小鼠肺部炎癥模型，注入脂多糖3 h后用反轉錄-聚合酶鏈反應技術從肺中檢測到46種 miRNA的表達改變，其中以 miR-21、miR-25、miR-27b、miR-100、miR-140、miR-142-3p、miR-181c、miR-187、miR-194、miR-214、miR-223、miR-224 等 12種miRNA表達上調尤為明顯，并與肺部浸潤的炎性細胞、細胞因子增多密切相關，提示miRNA在肺部炎性反應種扮演重要的角色。Rodriguez等［22］研究顯示，缺乏miR-155的小鼠肺的重構性增強，支氣管肺泡中白細胞數量增加，并且檢測出炎性刺激時B細胞、T細胞反應減弱和樹突狀細胞功能下降。這證實了miR-155在調節與T細胞功能相關的基因表達和炎性反應方面有重要作用。Johnnidis等［23］以去除了編碼miR-223基因的小鼠為研究對象，觀察到了過度成熟的粒細胞表型，對外界刺激的敏感性上調，同時實驗顯示這些小鼠會產生自發性的肺部炎性反應，在非致死濃度的脂多糖的刺激下即可產生嚴重的炎性反應組織損傷，提示miR-223在肺組織粒細胞的炎性反應調節中起著重要作用。在人肺泡上皮細胞中的研究有:Perry等［24］研究表明使用白細胞介素1β(interleukin-1beta，IL-1β)刺激人肺泡上皮細胞系A549后很快在肺泡上皮細胞中檢測到miR-146a和miR-146b這兩種miRNA的表達水平上調，但是在支氣管上皮細胞中只檢測到miR-146a上調;提前用地塞米松處理的組別中仍能檢測到miR-146a和miR-146b的表達水平上調，但是其上調水平有所下降。進一步的研究表明抑制miR-146a導致白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)、調節正常T細胞表達和分泌的細胞因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted，RANTES)的釋放增加，抑制miR-146b可輕微降低IL-8的產生，對RANTES的影響不甚明顯。而 miR-146a、miR-146b對 IL-8和RANTES的mRNA轉錄水平無影響，提示miR-146a、miR-146b在肺炎性反應中表達上調可能是通過抑制IL-8和RANTES蛋白的翻譯過程來調節炎性反應的。

5 miRNA在I/R過程中表達變化的研究進展

5.1 miRNA在腦I/R過程中的表達 Jeyaseelan等［25］在2008年通過構建局灶性腦缺血模型，發現再灌注24 h 和 48 h 后，let-7、miR-7、miR-27a、miR-98、miR-137、miR-204、miR-218、miR-301、miR-338、miR-335、miR-376、miR-424 等下調;miR-210、miR-215、miR-451、miR-497、miR-134等上調，同時研究證實在急性腦缺血早期主要病理變化尚未出現時，miRNA的表達已經發生了明顯變化，表明miRNA在神經系統缺血期的病理過程中發揮著重要作用。

5.2 miRNA在肝 I/R過程中的表達 有文獻報道［26］通過制作肝I/R模型，發現缺血2 h后miR-223表達水平與丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶含量呈正相關。Xu等［27］隨后在缺血預處理后的肝I/R模型中檢測到78種miRNA發生了至少2倍差別的變化，其中40種下調、38種上調，與未預處理的肝 I/R 組比較，miR-23a、miR-326、miR-346、miR-370顯著表達下調，提示miRNA在肝I/R過程中同樣發揮著重要作用。

5.3 miRNA在心肌I/R過程中的表達 Tang等［28］在大鼠心肌I/R模型中發現miR-1與Bcl-2蛋白表達呈負相關，同時在體外實驗中證實miR-1在缺氧環境中明顯上調，并明確了miR-1的靶基因是Bcl-2。miR-1抑制Bcl-2的蛋白表達，從而在心肌細胞的凋亡中發揮作用。同年，Ren等［29］通過體內外實驗發現miR-320在心肌缺血情況下表達顯著下調，并發現miR-320過表達時心肌細胞凋亡明顯上升。潘振偉等［30］利用手術套管法建立原位大鼠心肌缺血預適應模型發現，建模4 h后I/R區心肌rno-miR-206、btalet-7g、rno-let-7c、rno-let-7f、rno-miR-1 等 5 個 miRNA表達上調，rno-miR-7d* 、rno-miR-193、rno-miR-290、rno-miR-292-5p等4個miRNA表達下調，但是miRNA在心肌I/R過程中的作用值得進一步研究。

5.4 miRNA在腎I/R過程中的表達 吳鈺等［31］采用雙側夾閉小鼠腎蒂的方法制造急性I/R腎損傷模型，發現在腎I/R 4 h及24 h后miRNA-92a的表達水平顯著上調，同時提示miRNA-92a在缺血性疾病中可以誘導靶向血管相關因子，并且可能參與血管新生的信號途徑，促進血管生成，提示miRNA在腎I/R過程中承擔重要的角色。

6 結語

miRNA在多種器官組織I/R過程中發揮著重要作用:一部分miRNA可能促進細胞的增殖與分化，另一部分miRNA可能促進細胞的凋亡，加重組織的損傷。隨著目前科學技術的不斷發展，越來越多的miRNA將不斷被發現，哪種miRNA在I/R過程中發揮哪種作用也會得以明確。相信在不久的將來，miRNA可能是早期診斷與治療I/R及其他相關疾病的非常有效的新靶點之一。

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