血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子治療缺氧缺血性腦損傷的研究進(jìn)展

盧保霞(綜述)，徐家麗(審校)

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽蚌埠 233004;2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，安徽 蚌埠 233004)

缺氧缺血性腦病是新生兒神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)病，可致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。我國(guó)缺氧缺血性腦病的發(fā)病率較高，而該病的治療尚無(wú)有效的方法。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)具有神經(jīng)保護(hù)作用，不同的用藥方法(如腦室輸注、靜脈推注、經(jīng)鼻給藥、轉(zhuǎn)基因治療等)、用藥時(shí)間和藥物劑量使其產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用的效果差異較大。

1 VEGF的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性

VEGF是Senger等［1］在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，能引起小靜脈對(duì)血液中大分子物質(zhì)通透性改變。在血管內(nèi)皮細(xì)胞上具有與VEGF高度特異性和親和力的受體，VEGF與其結(jié)合可引起胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度短暫性升高，刺激三磷酸肌醇積聚，通過(guò)磷酸激酶特異性磷脂酶C完成自身磷酸化，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、遷移和增殖。缺氧時(shí)，VEGF可以維持內(nèi)皮細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)，減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

2 VEGF對(duì)缺氧缺血腦組織的保護(hù)作用

低氧作為一種信號(hào)刺激VEGF分泌并促進(jìn)缺氧缺血腦組織VEGF高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，誘導(dǎo)大量新生血管形成，改善損傷腦組織血流供應(yīng)，減輕腦損傷。同時(shí)，VEGF作為神經(jīng)保護(hù)因子，減少缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

2.1 VEGF及其受體的高表達(dá) VEGF的受體存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上。Gustavsson等［2］在SD大鼠缺氧預(yù)處理觀察血管反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是成年鼠還是幼鼠在缺氧合并缺血后，腦組織中VEGF及其受體表達(dá)均成倍增加。體外細(xì)胞缺氧培養(yǎng)時(shí)VEGF表達(dá)也上調(diào)，體外缺氧培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)液中VEGF顯著上升，表達(dá)VEGF受體的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)也顯著上升。

2.2 VEGF的抗凋亡作用 腦對(duì)缺氧最敏感，缺氧時(shí)神經(jīng)細(xì)胞受損，caspase-3被激活為有活性的酶，降解下游底物(如DNA修復(fù)酶、DNA依賴(lài)蛋白激酶、蛋白激酶C、Rb基因、DNA酶等)，使細(xì)胞凋亡事件完成且不可逆轉(zhuǎn)。VEGF可以抑制腦內(nèi)caspase-3的活化，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。缺氧在誘導(dǎo)VEGF產(chǎn)生的同時(shí)也可誘導(dǎo)血紅素加氧酶1的產(chǎn)生。VEGF與血紅素加氧酶1間存在著正反饋效應(yīng)。后者參與血紅素的代謝，代謝產(chǎn)物包括CO、Fe2+和膽綠素等，其中Fe2+參與鐵蛋白的合成，而鐵蛋白和膽綠素是體內(nèi)重要的抗氧化劑，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用。VEGF可增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的基因表達(dá)，并使細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜的能力增強(qiáng)，加強(qiáng)葡萄糖的腦內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)抗缺氧缺血后腦內(nèi)能量的衰竭而對(duì)抗凋亡。

2.3 對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞的作用 VEGF可促進(jìn)培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞有絲分裂，刺激Schwann細(xì)胞增生和延長(zhǎng)其成活時(shí)間。Wang等［3］在采用側(cè)腦室注入的方式給予大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷模型外源性VEGF的研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF可刺激神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活和軸突生長(zhǎng)。

2.4 VEGF對(duì)神經(jīng)發(fā)生的促進(jìn)作用 Palmer等［4］在成年海馬神經(jīng)的實(shí)驗(yàn)研究中觀察到大腦再生的神經(jīng)元主要在血管周?chē)崾綱EGF的促神經(jīng)再生作用。Horie等［5］在研究不同氧氣濃度對(duì)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖和分化實(shí)驗(yàn)中證明缺氧可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及分化，且與VEGF表達(dá)有關(guān)。缺氧導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞VEGF的表達(dá)增加并誘導(dǎo)神經(jīng)祖細(xì)胞遷移，VEGF表達(dá)上調(diào)與神經(jīng)祖細(xì)胞遷移呈正相關(guān)。

3 VEGF治療缺氧缺血腦損傷的給藥方法

3.1 VEGF與血-腦脊液屏障 VEGF具有很強(qiáng)的增強(qiáng)微血管通透性的作用，特別是毛細(xì)血管后微靜脈和小靜脈。血-腦脊液屏障在大腦微環(huán)境的穩(wěn)定中起重要作用。缺氧可導(dǎo)致血-腦脊液屏障通透性增加，并直接與VEGF表達(dá)上調(diào)有關(guān)［6］。在缺血和有炎癥時(shí)VEGF可通過(guò)改變血-腦脊液屏障的緊密連接提高其通透性［7-8］。Kilic等［9］觀察到磷脂酰肌醇3激酶/Akt途徑介導(dǎo)VEGF在局灶性腦缺血后血-腦脊液屏障通透性發(fā)生改變，發(fā)現(xiàn)VEGF的神經(jīng)保護(hù)作用常伴隨血-腦脊液屏障通透性的增加，這就限制了VEGF神經(jīng)保護(hù)作用在臨床上的應(yīng)用。如何發(fā)揮藥物的神經(jīng)保護(hù)作用又減少血-腦脊液屏障通透性增加帶來(lái)的不良反應(yīng)具有重要意義。

3.2 給藥途徑及劑量

3.2.1 給藥途徑 研究發(fā)現(xiàn)在缺氧缺血后一次性低劑量向腦室內(nèi)輸注VEGF不僅可發(fā)揮VEGF的神經(jīng)保護(hù)作用，還可避免其增加血管通透性，提示選擇適當(dāng)?shù)慕o藥方式可以避免不良反應(yīng)。注入腦室給藥是有創(chuàng)操作，容易損傷大腦，導(dǎo)致顱內(nèi)感染。Hayashi等［10］發(fā)現(xiàn)雄性Wistar大鼠局灶腦缺血后即靜脈注射重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(rhVEGF165)后，局灶腦缺血的半暗帶區(qū)血管生成增多，在缺血早期應(yīng)用rhVEGF165增加了血-腦脊液屏障滲漏和出血傾向，加重了缺血損傷，結(jié)果提示，在急性期應(yīng)用VEGF會(huì)增加出血轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)，VEGF的半衰期很短，靜脈給藥需要持續(xù)給藥，而VEGF價(jià)格昂貴，臨床應(yīng)用會(huì)給患者很大的經(jīng)濟(jì)壓力。De Rosa等［11］在經(jīng)鼻腔給予抗神經(jīng)生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子實(shí)驗(yàn)研究中，觀察到一些大分子蛋白物質(zhì)經(jīng)鼻腔給藥后在嗅球高濃度聚集而血藥濃度并無(wú)明顯升高的現(xiàn)象，提示嗅黏膜與大腦之間存在一條繞過(guò)血-腦脊液屏障的直接通路。該通路的存在為VEGF提供了直接進(jìn)入中樞神經(jīng)的無(wú)創(chuàng)給藥途徑，也為中樞神經(jīng)系統(tǒng)獲得顯著提高的藥物濃度和藥效提供了極大的方便。

3.2.2 給藥劑量 Yasuhara等［12］研究顯示，經(jīng)大腦紋狀體途徑補(bǔ)充VEGF時(shí)對(duì)多巴胺能神經(jīng)元有保護(hù)作用，1 μg/L VEGF的保護(hù)作用強(qiáng)于100 μg/L的保護(hù)作用，且高劑量VEGF還可導(dǎo)致腦水腫。此外，較大劑量的VEGF不僅可導(dǎo)致血-腦脊液屏障破壞，還可導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元退變。楊冀萍等［13］發(fā)現(xiàn)在大鼠MCAO模型中經(jīng)鼻給予VEGF 100 mg/L(300 μL)不能減少梗死體積，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，也不能誘導(dǎo)血管發(fā)生;而給予VEGF 200 mg/L(300 μL)既可以降低梗死體積，又可以促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)以及誘導(dǎo)血管生成;但500 mg/L(300 μL)可以誘導(dǎo)血管生成，卻不能減少梗死體積和促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)。因此，應(yīng)使用合適劑量，在充分發(fā)揮VEGF神經(jīng)保護(hù)功效的同時(shí)，避免帶來(lái)的負(fù)面影響，這一劑量還需實(shí)驗(yàn)研究不斷探索。

3.3 VEGF的轉(zhuǎn)基因治療

3.3.1 基因載體 VEGF蛋白不僅難以透過(guò)血-腦脊液屏障而且半衰期很短，在循環(huán)中很快降解。轉(zhuǎn)基因治療法可以突破血-腦脊液屏障的限制，并產(chǎn)生穩(wěn)定的VEGF蛋白表達(dá)，產(chǎn)生長(zhǎng)期穩(wěn)定的療效。關(guān)鍵是選擇基因載體，理想的載體應(yīng)該具備如下特性:①較高的濃度(病毒數(shù)＞104/L);可以感染多種細(xì)胞。②方便制備并且能夠復(fù)制。③可以整合進(jìn)入宿主的特定染色體位點(diǎn)或保持穩(wěn)定的游離基因。④具有與調(diào)控元件相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄單元。⑤能靶向感染目標(biāo)細(xì)胞。⑥無(wú)免疫原性。腺病毒系統(tǒng)安全、遺傳毒性低、感染率高、易繁殖、宿主廣泛，其并不整合到宿主細(xì)胞，不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)［14-16］。Bellomo 等［17］分別構(gòu)建了表達(dá)LacZ標(biāo)示基因的重組腺病毒(rAAV-LacZ)和VEGF165cDNA的重組腺病毒(rAAV-VEGE165)載體，立體定向注射到沙土鼠左側(cè)腦室，6、12 d后將這些動(dòng)物手術(shù)制做腦缺血/再灌注模型，分別評(píng)價(jià)腦水腫、CA1區(qū)的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡等指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以rAAV-VEGE165處理的沙土鼠丘腦及皮質(zhì)區(qū)免疫組化有明顯的VEGF陽(yáng)性染色，沙土鼠在腦缺血/再灌注后24 h的生存率明顯高于rAAV-LacZ處理組，同時(shí)其腦組織含水量亦明顯減少，說(shuō)明可顯著減輕腦梗死后的腦水腫程度，組織學(xué)觀察證實(shí)海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元死亡數(shù)量顯著少于rAAV-LacZ處理組。Zheng等［16］將腺病毒介導(dǎo)的VEGF165轉(zhuǎn)導(dǎo)至缺氧缺血性腦損傷7 d齡SD大鼠腦組織中，發(fā)現(xiàn)腺病毒介導(dǎo)的VEGF165能誘導(dǎo)腦組織的神經(jīng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGF蛋白，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)抗凋亡基因及促凋亡基因表達(dá)有關(guān)的分子機(jī)制對(duì)缺氧缺血/再灌注后腦損傷發(fā)揮保護(hù)治療作用。腺病毒系統(tǒng)的缺點(diǎn)是免疫原性，基因表達(dá)時(shí)間短暫，基因容量小。慢病毒載體可感染各種細(xì)胞整合人基因組，持續(xù)表達(dá)，免疫原性低。基因容量小，有致基因突變的可能。納米顆粒作為載體性質(zhì)穩(wěn)定，易于制備，可較長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)表達(dá)，無(wú)免疫原性，缺點(diǎn)是易受體內(nèi)玻璃質(zhì)等物理化學(xué)屏障影響［18］。

3.3.2 聯(lián)合其他基因治療 趙英杰等［19］在成年雄性Wistar大鼠腦缺血模型上聯(lián)合應(yīng)用外源性VEGF165和促血管生成素1基因治療，發(fā)現(xiàn)外源性VEGF165和促血管生成素1基因合用可以保護(hù)腦細(xì)胞，促進(jìn)新生血管生成，減輕腦水腫，改善大鼠腦神經(jīng)功能。熱休克蛋白表達(dá)都有不同程度的上調(diào)及減輕缺血后的神經(jīng)元損傷。已在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ万?yàn)證了轉(zhuǎn)基因技術(shù)外源性過(guò)度表達(dá)熱休克蛋白的神經(jīng)保護(hù)作用［20］。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在缺血組織導(dǎo)入多種抗氧化酶基因雖可保護(hù)缺血缺氧后的神經(jīng)元，但轉(zhuǎn)基因的安全性有待確定［21］。

3.4 給藥時(shí)間窗 缺氧缺血性腦病治療的“時(shí)間窗”一直是臨床醫(yī)師及科學(xué)研究者共同關(guān)心的問(wèn)題。對(duì)于缺氧缺血性腦損傷后不同階段的認(rèn)識(shí)有助于了解缺氧缺血性腦病治療的“時(shí)間窗”。缺氧缺血性損傷后組織細(xì)胞能量及代謝變化分為兩個(gè)階段:原發(fā)性細(xì)胞損傷階段和遲發(fā)性細(xì)胞損傷階段——繼發(fā)性能量衰竭。二次能量衰竭之間的潛伏期亦就是所謂的治療“時(shí)間窗”，是減輕腦損傷的神經(jīng)保護(hù)措施能被成功應(yīng)用的最佳時(shí)期。此間期在動(dòng)物模型為6～15 h，在人類(lèi)新生兒中可能更短(6 h左右)。

4 結(jié)語(yǔ)

目前，人們逐步認(rèn)識(shí)到VEGF在缺氧缺血腦病中的重要作用。目前對(duì)VEGF的研究主要集中在嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型上，VEGF對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一切活性作用在動(dòng)物模型上已經(jīng)得到廣泛證實(shí)，臨床治療上尚缺乏更全面的臨床證據(jù)的支持。因此，VEGF真正能在新生兒缺血缺氧腦病中應(yīng)用還存在用藥的安全劑量和安全有效的給藥方法等很多具體的問(wèn)題。

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