促凋亡基因puma與腫瘤治療

王明立(綜述)，段 勇，王玉明(審校)

(昆明醫學院第一附屬醫院檢驗科，昆明 650032)

自20世紀70年代以來，我國的惡性腫瘤發病率及病死率一直呈上升的趨勢，癌癥已成為中國城市和農村居民的第一位死因。腫瘤的發生、發展涉及癌基因的激活及抑癌基因的失活，同時與凋亡失衡也密切相關。近年來研究表明，凋亡相關基因的改變與惡性腫瘤的發生、發展及預后有一定關系［1］。puma是2001年新發現的一種促凋亡基因，是Bcl-2家族BH3-only亞家族成員，可依賴和不依賴p53快速誘導凋亡［2-4］。puma的表達及作用與腫瘤發生密切相關，外源性導入puma基因可誘導腫瘤細胞的凋亡并提升放療和化療的效果。

1 puma的結構和功能

2001 年，三個科研小組［2，5-6］相繼發現了 puma基因。人puma基因定位于19q，cDNA長1.9 kb，富含GC序列。該基因包含4個外顯子(1a或1b、2、3、4，其中外顯子2含假定的轉錄起始密碼子，外顯子3中含編碼BH3的序列)和3個內含子，轉錄后形成4種不同剪接體(puma-α、-β、-γ 和-δ，其中 puma-α 和puma-β含有 BH3結構域，具有誘導凋亡的功能［5，7］)。puma的轉錄起始位點上游存在兩個 p53結合位點BS1和BS2，p53與BS2結合后可顯著促進 puma的轉錄［2，5］。puma 編碼 193 個氨基酸的蛋白，借助C端43個氨基酸殘基定位于線粒體并誘導凋亡。

puma在生理狀態下表達量較低，但當機體受到刺激后在細胞凋亡早期就可表達，并通過多種途徑加速細胞凋亡。puma可通過p53依賴途徑和p53非依賴途徑誘導凋亡，由射線照射、DNA損傷藥物、缺氧和一氧化氮等引起的細胞凋亡作用是通過p53依賴途徑實現的［8-9］，而血清饑餓、缺血/再灌注、細胞因子撤除等刺激則誘導p53非依賴的凋亡途徑［10-12］。

2 puma在癌組織中的表達和作用

puma基因在人體各種癌組織中的表達不一。Jansson等［13］對散發大腸癌的研究顯示，puma mRNA和蛋白在腫瘤組織的表達與正常黏膜組織相比存在上調和下調。王玉明等［14］對非小細胞肺癌的研究表明，puma mRNA和蛋白在癌組織、癌旁、遠癌及肺良性病變組織中的表達差異無統計學意義。Karst等［15］對原發性、轉移性黑色素瘤及惡變痣的研究發現，puma表達在各組間存在差異且與惡性程度呈負相關;免疫組織化學的方法也顯示，puma在喉鱗狀細胞癌及胰腺導管腺癌中的表達低于癌旁組織。puma在多種癌組織中低表達，有研究報道［16］，剔除puma可增強氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉(AOM/DSS)誘導的小鼠結腸癌的形成，表明puma有抑制腫瘤生成的作用。

3 puma與腫瘤治療

腫瘤是由細胞異常增殖、分化停滯以及細胞凋亡失衡所致。選擇性誘導腫瘤細胞的凋亡并同時減少正常組織細胞的凋亡，是腫瘤治療學研究的熱點。在腫瘤的治療中，選擇性的增加促凋亡基因的活性，可以增加放化療的效果，并減少其不良反應。

3.1 puma與基因治療 通過載體向腫瘤細胞靶向導入puma基因或剔除/剔低對puma有抑制作用的基因，誘導腫瘤細胞的凋亡，可能是一種可行并有效的治療方法。張宇雯等［17］利用脂質體將攜帶puma cDNA的表達載體導入體外培養的胃癌SGC-7901細胞，發現轉染puma后癌細胞的增殖能力明顯低于轉染空載體組和陰性對照組，而細胞凋亡的比例卻明顯高于這兩組。張克君等［18］用不同感染指數的攜帶puma的重組腺病毒載體(ad-puma)轉染人胰腺癌細胞株AsPC-1的研究發現，隨著感染滴度的增加，細胞內puma表達逐漸增加，且隨puma表達上調胰腺癌細胞的生長抑制增加。裸鼠移植瘤試驗發現，ad-puma轉染可抑制腫瘤生長。Yeh等［19］采用聚乙烯亞胺介導puma基因導入原位口腔癌SAS細胞發現，puma在體外和裸鼠移植瘤體內經線粒體途徑誘導凋亡，且可使移植瘤生長受抑，并延長患病小鼠的生存期。

研究報道，S1ug是puma的強烈抑制基因，Zhang等［20］采用Slug siRNA沉默膽管癌細胞的S1ug基因后，S1ug被抑制同時puma表達上調，細胞凋亡率明顯提高，裸鼠移植瘤生長受抑。近年發現，部分miRNAs以puma為靶基因并抑制其表達。在EB病毒感染所致的鼻咽癌中miR-BART5高表達而puma低表達，對含EB病毒的鼻咽癌細胞系C666-1抑制miR-BART5后則誘導凋亡［21］。miR-221/222靶作用于 puma抑制人膠質瘤細胞的凋亡，剔除miR-221/222后puma表達和細胞凋亡增高、移植瘤生長減慢［22］。

3.2 puma與放射和化學治療 放療和化療是臨床治療癌癥的常規方法，癌細胞出現放、化療耐受是影響療效的主要原因之一，而某些癌細胞對放、化療耐受與癌細胞喪失凋亡能力有關［23］。

2006年，Yu等［24］用 ad-puma轉染肺癌 A549細胞，并分別同時給以γ線照射和化療藥物(紫杉醇、氟尿嘧啶、奧沙利鉑、順鉑、依托泊苷和阿霉素)處理，結果顯示puma通過誘導凋亡顯著增強肺癌細胞對放射治療和化療藥物的敏感性，且puma在此的增敏作用與p53的存在狀態無關。2007年，Chen等［25］在體外和裸鼠體內對耐藥絨癌jeg-3/vp16細胞的研究表明，ad-puma導入可加強抗癌藥物誘導的凋亡，并可恢復藥物抵抗絨毛膜癌細胞對化療藥物(氟尿嘧啶，依托泊苷或甲氨蝶呤)的敏感性。同年，Sun等［26］對頭頸鱗癌的研究發現，puma活性缺失可促使產生化學抵抗，而導入ad-puma后可使頭頸鱗癌細胞對順鉑敏感。

2009年，朱東明等［27］對胰腺癌PANC-1細胞及其移植瘤分別進行轉染puma、射線照射和聯合轉染照射的處理后發現，聯合處理組細胞生長抑制率和凋亡率明顯高于單純轉染組和單純照射組，而移植瘤平均生長速率明顯低于這兩組。2010年，Zhang等［28］對膽管癌QBC939細胞的分析顯示，放射處理可以上調puma的表達及增加細胞凋亡，剔除puma抑制基因后再行放射處理凋亡更加明顯，移植瘤生長明顯受抑。

2011年，Jung等［29］對腎癌 Caki細胞的研究表明，褪黑素和咖啡豆醇同時處理細胞可以上調puma，此上調作用與p53的狀態無關，由內質網應急相關蛋白CHOP介導;而Caki細胞通過siRNA剔除puma后，褪黑素和咖啡豆醇引起的細胞凋亡受到抑制。

3.3 puma與其他基因、因子等的聯合治療 近年來研究表明，某些因子可上調或抑制puma的表達。Gao等［30］研究發現，干擾素調節因子 1(interferon regulatory factor-1，IRF-1)通過上調puma經線粒體途徑誘導凋亡，在puma剔除和剔低的細胞IRF-1誘導的凋亡明顯減低，并首次證實了puma是IRF-1的調節基因及干擾素γ可不依賴p53誘導puma的表達。Nathan等［31］的研究顯示剔除，CCCTC 結合因子(CTCF)可使puma表達明顯增高，這一過程沒有p53及其他p53靶基因的激活。

針對癌基因Mdm2與p53間相互作用的小分子抑制劑的應用是腫瘤治療的一個重要方向。Mdm2的抑制劑Nutlin-3通過與Mdm2結合，抑制Mdm2和p53的相互作用，從而激活p53，誘導細胞凋亡，并發揮抗腫瘤作用。近年又有研究發現，在缺乏p53的人結腸癌Caco2細胞，Nutlin-3介導的Mdm2降解引起p73的積聚，繼而誘導puma的表達［32］。

4 puma與細胞保護

外源性導入puma基因增加puma表達，可有效抑制腫瘤細胞的生長，增強腫瘤放化療的效果，但同時也增加了正常細胞的凋亡，如何增加puma基因的靶向性及保護正常細胞免受損傷已成為目前面臨的主要問題。骨髓損傷是腫瘤放化療的主要不良反應之一。Yu等［33］的研究發現，在高劑量放射處理時puma缺失可保護造血干細胞并延長其存活時間。Shao等［34］的研究也得出類似結論，并發現這種保護作用強弱與puma缺失的基因量有關。通過其他因子抑制puma基因是降低puma表達的一種可行途徑，Qiu等［35］的研究表明，生長因子通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/p53的軸向作用抑制puma表達，并抑制放射引起的腸干細胞的凋亡。Inoue等［36］研究發現，白細胞介素15通過減少促凋亡基因Bim和puma的表達抑制免疫細胞凋亡。此外，Mustata等［37］的研究也表明，開發及應用 puma的小分子抑制劑可能是降低puma表達及減少放射引起細胞死亡的安全有效的方法。

5 問題與展望

大量研究已表明，puma在多種癌組織中呈低表達，外源性導入puma或剔除其抑制基因增高puma的表達均可誘導腫瘤細胞的凋亡，且puma與放療、化療劑同時使用會提升放化療的效果。但如何提高puma在腫瘤治療中的靶向性及降低轉染載體的毒性，在特異性增高puma在腫瘤細胞表達的同時不增高正常細胞的puma表達，降低放化療對正常細胞的損傷，仍然是puma下一步研究的重點。盡管目前puma基因用于治療腫瘤還未能從實驗室走向臨床，但隨著puma功能研究的不斷深入，相信puma基因的應用能很快為腫瘤的治療和預防提供新的有效的方法。

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