TNF-α介導的NF-κB信號通路在類風濕性關節炎血管形成中的作用

石 慧，王丹彤，烏日嘎(綜述)，李鴻斌(審校)

(1．內蒙古醫學院第三附屬醫院(包鋼醫院)，內蒙包頭014010;2．內蒙古醫學院第一附屬醫院，呼和浩特010010)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種不明原因的多系統性自身免疫性疾病，以關節滑膜炎、血管翳及對稱性、破壞性的關節病變為主要特征。RA的病理過程有多種免疫細胞、細胞因子及細胞信號通路參與。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factoralpha，TNF-α)是 RA 病程中最早產生的細胞因子之一，可與其他細胞因子一起促進RA滑膜血管新生。核因子κB(nu-clear factor-κB，NF-κB)是真核細胞內廣泛存在的核轉錄因子，在細胞凋亡、病毒復制、腫瘤發生、炎癥及各種免疫疾病等的基因表達中發揮了重要的作用。TNF-α刺激NF-κB信號轉導通路激活在RA炎性反應、血管形成中發揮重要作用，研究此信號通路并尋找針對通路中各環節的靶向治療對RA有重要意義。

1 TNF-α在RA中的作用

TNF是一種具有廣泛生物學效應的細胞因子，按其結構分2型:TNF-α和 TNF-β，TNF-α由活化的巨噬細胞、單核細胞和T淋巴細胞產生，TNF-β由活化的T細胞和自然殺傷細胞產生，TNF中發揮主要生物學活性的是TNF-α。TNF-α通過細胞膜上的腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)發揮生物學活性，TNFR按相對分子質量分為兩類，TNFR1(p55R)和TNFR2(p75R)，它們的胞外區都含有4個富含半胱氨酸的結構域(cysteine-rich-domain，CRD)，每個CRD由6個半胱氨酸組成，形成3對二硫鍵，CRD獨特的結構決定了TNF-α與受體之間的特異性結合，與TNF-α結合部位是CRD2和CRD3。TNFR1和TNFR2與各自配體結合，激活特異信號通路，參與不同的效應。TNFR1在細胞損傷、成纖維細胞增殖以及細胞程序性死亡、激活NF-κB等多種生物活性的信號傳遞方面起重要作用;TNFR2通過與TNFR相關因子(TNFR-associated factor，TRAF)結合形成復合體激活NF-κB和JNK激酶，誘導基因轉錄。TNFR1和TNFR2也可共同參與完成某些生物功能。

TNF-α通過抑制骨膠原合成、刺激成纖維細胞和軟骨細胞產生前列腺素和膠原酶、刺激軟骨細胞分泌金屬蛋白酶、升高纖溶酶激活劑的濃度、誘導外周血單核細胞分化為破骨細胞等途徑，促進軟骨破壞，加重炎性反應，進而促進RA的發生。在RA活動期或進展期，TNF-α呈高水平分泌。研究證實在RA患者外周單核細胞和關節滑膜液的吞噬細胞能分泌TNF-α，使外周血和關節滑液TNF-α增高。李芳等［1］測定RA患者血清TNF-α水平顯著高于正常對照組，且與關節疼痛數、關節腫脹數、紅細胞沉降率、C反應蛋白、類風濕因子及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)正相關，說明TNF-α與 RA活動度、滑膜炎、血管形成相關。Izquierdo等［2］比較RA、骨性關節炎與正常對照組關節鏡下滑膜組織病理提示，RA患者滑膜組織含有大量不成熟的缺乏外周內皮細胞覆蓋的血管，在RA早期就出現、并與時間、疾病活動性、嚴重性及細胞浸潤程度相關，用TNF-α拮抗劑治療后不成熟血管選擇性耗盡。而骨性關節炎患者缺乏這種血管、正常組未發現這種血管。

TNF-α也可與其他細胞因子協同作用促進血管形成，它可上調 VEGF的分泌，使之通過提高血管通透性、促進纖溶酶原激活劑及其蛋白質分解酶的釋放、降解毛細血管基膜、刺激內皮細胞遷移和趨化、誘使匯聚的微血管內皮細胞侵入纖維凝膠并形成管樣結構等途徑促進新生血管的形成，有研究表明膠原誘導性關節炎大鼠的血清 TNF-α含量與滑膜VEGF、滑膜血管增生、新生血管形成相關［3］。Cha等［4］用 TNF-α 刺激滑膜成纖維細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)，可顯著增加VEGF-mRNA及蛋白表達，并呈劑量依賴性。TNF-α能刺激粒細胞巨噬細胞刺激因子、白細胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8的產生，并激活地諾前列酮和膠原酶，引起血管生成;TNF-α與轉化生長因子可產生協同效應，誘導血管生成［5］;TNF-α 能通過整合素 αvβ3完成對血管新生的作用。這些機制均參與了血管翳的生成。但Hashizume等［6］證實 TNF-α 在體外有抑制血管的作用，可能與 TNF-α在體外發生生物學活性的改變有關。

2 NF-κB通路與RA

NF-κB是由5種亞單位構成的同源或異源二聚體蛋白質，哺乳動物 NF-κB家族包括 Rel(c-Rel)、RelA(p65)、RelB、NF-κB1(p50)和 NF-κB2(p52)，細胞中最常見的NF-κB是p65/p50復合體。所有NF-κB的N末端都含有約300個氨基酸構成的Rel同源結構域(RHD)，該區域參與DNA的結合及二聚體形成。RHD的C末端含有核定位序列。IκB是NF-κB的抑制蛋白。IκB 蛋白家族包括:IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBε、Bcl-3、p105(NF-κB1)、p100(NF-κB2)及 molecule possessing ankyrin-repeats induced by lipopolysaccharide(MAIL，脂多糖誘導性錨蛋白重復性分子蛋白)。靜息細胞中NF-κB與IκB蛋白結合，使NF-κB二聚體與IκB形成的三聚體隱蔽于細胞質。IκB的N端含有Ser磷酸化位點及泛素化位點，在IκB降解時發揮重要功能;IκB的 C端有 proline，glutamate，serine，and threonine(PEST，脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸)序列，是蛋白酶作用的靶點，與IκB的降解有關，它在穩定IκB分子及抑制NF-κB與DNA結合中發揮作用。IKK(IκB kinase)是激活NF-κB經典路徑的關鍵，由IKKα、IKKβ、IKKγ 3個亞基組成，其中IKKα和IKKβ為催化亞基，IKKγ為調節亞基。IKKα和IKKβ都含有N端的蛋白激酶結構域和亮氨酸拉鏈形成的環狀結構域，此區域中保守位點的磷酸化會導致激酶結構的改變，從而使其獲得活性。

當細胞受到TNF等刺激時，NF-κB經典通路激活，在IKK復合物和E3 IκB-泛素連接酶復合物作用下，IKKα和IKKβ亞基可特異地將IκBα分子Ser32/Ser36、IκBβ 分 子 的 Ser19/Ser23、IκBγ 分 子 的Ser157/Ser161殘基磷酸化，在26S蛋白酶體系統的作用下，IKB蛋白被降解，暴露核定位序列，導致NF-κB二聚體進入胞核調節基因轉錄。

Woo等［7］證實RA患者滑膜組織可檢測到NF-κB p65和NF-κB p50呈高表達狀態，表明 NF-κB參與RA病理過程，參與滑膜、血管增生。國內外有研究表明腫瘤的血管生成與NF-κB相關，抑制NF-κB活化可有效抑制腫瘤血管形成［8-9］，而RA血管翳具有類似于腫瘤組織的特性，故抑制NF-κB也可能成為將來控制RA血管形成的有效策略。

3 TNF-α介導的NF-κB通路與RA血管形成的關系

TNF-α最重要的一個下游信號通路是NF-κB轉錄因子的激活，它已經被確認參與炎癥、抗凋亡及免疫反應。TNF-α激活NF-κB通路有多種信號分子參與，包括 TNFR相關因子、RIP(receptor interacting protein)、MAP3K(mitogen-activated protein kinase kinase 3)、IKK復合物等。目前眾多研究多集中在識別該通路的信號元件的組成、翻譯后修改、亞細胞易位等方面。

3．1 TNF-α激活NF-κB的機制 在細胞表面，TNFR與其配體相結合后，可募集TNFR相關死亡結構域(TNFR-associated death domain，TRADD)，TRADD 可與 TRAF結合，活化受體相關蛋白 RIP，RIP與MAP3K相互作用使IKK的磷酸化，在活化的IKK的作用下IκBα被磷酸化，磷酸化的IκBα立即被一個泛素連接酶復合物SCF/βTrCP識別，然后被26s蛋白酶體識別并迅速降解。IκBα的降解使得核定位序列暴露出來，NF-κB活化而進入細胞核。發生核易位后，NF-κB與其目的靶基因的啟動子或增強子上特定的κB系列特異結合，啟動和調控RA炎性因子表達，促進滑膜血管翳形成。Calmon-Hamaty等［10］研究表明，RA成纖維細胞表達 TNF受體Ⅰ、Ⅱ，TNF-α刺激可使NF-κB表達顯著增加。

3．2 TNF-α激活NF-κB促進RA血管形成的途徑

TNF-α激活NF-κB信號通路誘導VEGF、組織因子和細胞間黏附分子1、血管細胞黏附分子1、環氧化酶2的表達，這些分子作用于血管內皮細胞［11-13］，促進滑膜血管翳的形成。

Cho等［14］研究報道了 CD40L-CD40系統具有與IL-1、TNF不同的信號轉導通路，兩者結合后通過激活下游NF-κB基因，最后啟動VEGF基因的表達，為新生血管提供條件。

Scott等［15］的研究表明，TNF-α 能通過激活蛋白1和NF-κB增加RA患者成纖維樣滑膜細胞中的血管生成素1(angiopoietin-1，Ang-1)mRNA的表達，促進血管發生、滑膜的增生。此級聯反應可以增強炎性細胞因子(TNF-α、VEGF、IL-1等)以及基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表達，從而造成關節軟骨的損傷、關節破壞。

在FLS 中，NF-κB 活化可以促進IL-1B、IL-6、IL-8、MMPs的產生，促進FLS增生，抑制FLS凋亡，從而出現滑膜血管翳形成，使細胞釋放更多的細胞因子和MMPs，增強 IKKβ 的功能，引起 IκB 的降解和 NF-κB核轉錄［16-17］。RA患者和正常人的FLS培養結果顯示，與正常人相比，RA滑膜細胞增生是通過激活TNFR相關因子，導致NF-κB活化，并阻礙了RA的FLS正常凋亡，最終使FLS的生長與死亡失衡，造成滑膜細胞過度增殖，滑膜組織增生［18］。

NF-κB是機體對于TNF-α產生生理性反應得到的重要中介物，NF-κB激活后也可以誘導TNF-α的表達、增強TNF-α基因轉錄，在某些細胞和組織中，NF-κB p65、TNF-α 兩者相互促進［19］，形成惡性循環，加重RA發展。

4 通過阻斷TNF-α介導的NF-κB信號途徑來治療RA

4．1 阻斷TNF-α TNF-α抑制劑是目前被批準的用于治療RA的生物制劑，有依那西普(etanercept)、英夫利西單抗(irdliximab)和阿達木單抗(adalimumab)。阻斷TNF-α可有效切斷該通路刺激信號下傳。大量研究表明［20］TNF-α抑制劑可有效改善滑膜缺氧、滑膜炎癥、血管形成。Wright等［21］證實RA患者中性粒細胞可表達 TNF-α的 mRNA、NF-κB，并顯著高于正常對照組，經TNF-α抑制劑治療后TNF-α回到基線水平。

4．2 阻斷NF-κB級聯反應

4．2．1 通過IκB 抑制NF-κB 由于IκB 的N 端含有Ser磷酸化及泛素化位點，在IκB降解發揮作用，因此，可通過阻斷IκB抑制Ser磷酸化及泛素化位點IκB激活。p65小干擾RNA(p65 siRNA)可以有效地抑制p65的表達，抑制NF-κB的激活，明顯減少TNF-α、IL-1β刺激軟骨細胞引起的環氧化酶、一氧化氮合酶、MMP-9 的表達［22］。

4．2．2 蛋白酶體抑制劑 26 S蛋白酶體抑制劑能抑制IκB的降解、NF-κB的核內移，有望成為治療RA的新途徑。Iguchi-Hashimoto等［23］證明在RA FLS中，鈣蛋白酶抑制劑可通過穩定IκB來抑制NF-κB表達，從而抑制細胞因子IL-6起到抗炎作用。

4．2．3 通過 IKK 抑制 NF-κB IKK 是 NF-κB 信號通路活化的主要調節物，抑制IKK激活來阻止IκB磷酸化從而間接抑制NF-κB信號通路激活。臨床上使用的阿司匹林、布洛芬等非甾體類消炎藥可抑制IKK的活性，阻止 NF-κB途徑的激活。Tsuchiya等［24］用一種新型的IKK抑制劑(CHOP)作用于RA滑膜組織表明，在FLS中，CHOP可抑制TNF-α刺激的炎性因子IL-6、IL-8的表達，減輕RA滑膜炎、血管翳。

4．3 阻斷NF-κB核定位 日本人 Okamoto等［25］證明絲氨酸-蘇氨酸抑制劑法舒地爾可抑制adjuvant-induced arthritis(AIA，佐劑誘導性關節炎)大鼠FLS細胞因子和內皮細胞的表達，抑制炎性反應和血管形成，阻止關節炎發展，其機制是通過抑制NF-κB與特定DNA序列綁定來發揮作用，且治療過程中無任何不良反應，對RA治療提供有效低毒的策略。

NF-κB誘捕性寡核苷酸是含有NF-κB結合位點的雙螺旋寡核苷酸，當 NF-κB 從 NF-κB-IκB 復合物中解離出來后，NF-κB誘捕性寡核苷酸即可與游離的NF-κB結合，從而封閉NF-κB，減少炎性介質的產生，減輕炎性反應和炎性損傷，在抑制腫瘤血管形成方面已有相關研究［8-9］，但對RA血管抑制作用尚不明確。

5 小結

RA早期的病理改變為持續性滑膜炎及血管翳的形成，尤其依賴于廣泛新生血管網形成。血管翳具有類似于腫瘤組織的特性——侵蝕性，它可侵蝕和破壞關節軟骨和骨組織，最終引起不可逆性的關節功能喪失。TNF-α介導的NF-κB通路在RA血管形成中發揮重要作用，TNF-α抑制劑已應用于臨床治療RA，并可有效減少滑膜血管化，但仍有相當數量的患者對此類藥無效。所以，研究TNF-α及下游信號通路NF-κB為靶點，篩選和設計高效低毒的抗RA新藥是將來研究的重點。

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