轉化生長因子β信號通路研究進展

秦慶華 姚詠明

轉化生長因子β信號通路研究進展

秦慶華 姚詠明

轉化生長因子－β(transforming growth factor－β，TGF－β)是生長因子超家族中具有免疫負調控功能的一大類細胞因子家族。現已知，幾乎體內所有的細胞均可分泌TGF－β并對TGF－β產生反應［1］;但有證據表明，Foxp3+調節性T細胞(Foxp3+Treg)是TGF－β的主要來源［2］。TGF－β超家族成員可調節多種細胞功能，包括細胞生長、黏附、遷移、分化和凋亡，并在調節炎癥反應、傷口愈合、免疫穩態及免疫耐受中發揮重要作用。TGF－β下游信號功能障礙參與了人類多種疾病的發病過程，如癌癥、纖維化、傷口愈合異常，以及多種遺傳性疾病，包括家族原發性肺動脈高壓、遺傳性出血性毛細血管擴張等［3］。此外，TGF－β信號通路在胚胎發育過程中具有重要作用［4］。在TGF－β家族成員中，TGF－β1是一種非常重要的細胞因子，它不僅能夠抑制上皮細胞的生長，而且能夠促進細胞的凋亡。本文擬就TGF－β相關信號通路研究進展進行綜述。

一、TGF－β超家族成員

TGF－β最早由Roberts等［5］從小鼠的肉瘤細胞中分離得到，是由二硫鍵相連形成的一種同源二聚體多肽分子，分子質量25kDa。TGF－β超家族成員又分為多個家族:TGF－β、活化素(activin)、Nodal家族和骨形成蛋白(BMP)、生長分化因子(GDF)、緩勒氏管抑制物(MIS)家族等。TGF－β超家族成員在進化過程中結構和功能高度保守，調節多種細胞的生長、分化，在胚胎發育、組織器官形態發生、細胞分化、增殖以及免疫調控等方面都發揮重要作用。在哺乳動物中至少發現有TGF－β1、TGF－β2、TGF－β33種TGF亞型，其中TGF－β1在人血小板和哺乳動物骨骼中含量最高。TGF－β以二聚體蛋白的形式在細胞內合成后，首先與潛活相關肽(LAP)以非共價鍵結合形成小潛活TGF－β復合物(SLC)，然后SLC再與潛活TGF－β結合蛋白(LTBP)以二硫鍵結合形成大潛活復合物(LLC)［6］。TGF－β以無活性的LLC的形式被分泌到細胞外，無活性TGF－β必須經過額外的激活步驟，例如蛋白酶解，或者通過細胞表面一些特殊受體的結合才能活化［1］。

二、TGF－β受體的結構與功能

TGF－β家族受體分為3型(TβRⅠ、Ⅱ、Ⅲ)。Ⅰ、Ⅱ型受體(TβRⅠ、Ⅱ)系具有絲/蘇氨酸激酶活性的Ⅰ型跨膜糖蛋白，一般由4部分構成:信號肽、親水胞外區、跨膜區和胞內區。人類基因組編碼5類TβRⅡ(TβRⅡ，ActR－Ⅱ，ActR－ⅡB，BMPR－Ⅱ，AMHR－Ⅱ)、7類TβRⅠ(activin receptor－like kinases 1－7，ALK1～7)［7］。這兩型受體的核心多肽含有約500～570個氨基酸殘基。親水胞外區相對較短(約150個氨基酸殘基)，胞外區近膜側有約10個半胱氨酸殘基組成的保守結構，稱為“Cys盒(Cys box)”，可被TβRⅡ磷酸化。在TβRⅠ的胞內側近膜部分有一高度保守的Ser－Gly－Ser－Gly－Ser－Gly序列(Gs結構域)，富含甘氨酸和絲氨酸;TβRⅡ胞質區的C端，即激酶區的遠膜端為22個氨基酸組成的富含絲氨酸和蘇氨酸的尾巴，可發生自身磷酸化。而TβRⅠ不能發生自身磷酸化，必須經TβRⅡ激酶磷酸化之后才有活性。TGF－β家族成員與相應受體結合的形式分兩種:第一種結合形式的配體包括TGF－β和活化素(activin)，這種配體不能直接結合TβRⅠ，必須首先與TβRⅡ結合，然后配體－TβRⅡ復合物再與TβRⅠ結合;第二種結合形式的配體主要是BMP，TβRⅠ和TβRⅡ同時與配體結合。在大多數情況下，TβRⅡ和TβRⅠ并不直接接觸，但通過與配體的結合之后能夠緊密聯系在一起。TGF－β在與受體結合后形成TβRⅠ－TGF－β－TβRⅡ異源四聚體，在TGF－β信號通路中將信號從胞膜外傳入胞核過程中發揮重要作用。TβRⅢ主要是β－聚糖和內皮因子。雖然目前尚未發現通過TβRⅢ激活的細胞內信號通路，但TβRⅢ確實能起到清除活化的TGF－β的功能。TβRⅢ的功能與其存在形式有關，當TβRⅢ以溶解形式存在時，可作為抑制劑抑制TGF－β結合至TβRⅡ上;但當TβRⅢ結合到細胞膜表面時，它們又能協助TGF－β與TβRⅡ的結合［1］。由此推測，TβRⅢ可能在TGF－β信號途徑的負反饋調節中發揮一定功能。另外，TβRⅢ還能抑制腫瘤細胞的轉移、浸潤、生長和血管的發生，顯示出TβRⅢ在腫瘤治療中的潛在應用價值［8］。

三、Smad的結構和功能

1．Smad分子的命名:1995年，Sekelsky等［9］在果蠅遺傳學研究中發現了能補救Dpp分子基因dpp缺失突變的分子，命名為Mad(mothers against dpp)，并證實Mad蛋白參與了TGF－β的信號轉導。不久在線蟲克隆出Mad相關基因，因這些基因突變可導致軀體變小(small body size)，將其命名為Sma2、Sma3、Sma4。Sma是Mad的同源物，因此將他們統一命名成Smad蛋白家族。Smad蛋白一般由400～500個氨基酸殘基構成，分子質量約為42kDa～60kDa。

2．Smad分子的分類:根據Smad蛋白結構和功能相似性，將其分為3類:①受體調控型Smad(receptor－regulated Smad，R－Smad)，包括Smad1、2、3、5、8。R－Smad分子C端具有特征性絲氨酸基序(SSXS motif)，可被活化的TβRⅠ磷酸化。該組Smad分子決定了配體信號轉導的特異性;②共用型Smad(common Smad，Co－Smad)，Co－Smad在脊椎動物中只有Smad4，所有TGF－β超家族中的信號分子在進入細胞核之前，均需要與Smad4結合;③抑制型Smad(inhibitory smad，I－smad)，包括Smad6、7。I－smad可以與R－Smad競爭結合活化的TβRⅠ，從而在TGF－β家族成員的信號轉導中發揮負調控效應。

3．Smad分子的結構與功能:R－Smad和Smad4包含兩個高度保守的結構域:即位于N端的Mad同源區1(MH1)和C端的Mad同源區2(MH2)。MH1和MH2由一保守度稍低，富含脯氨酸的連接區分隔開來。除Smad2外，R－Smad和Smad4的MH1結構域都能直接與DNA結合。連接區存在絲裂原活化蛋白激酶(MAPKS)、糖原合成酶－3β(GSK－3β)、泛素連接酶Smurf的連接位點，因此推測連接區是TGF－β信號通路與其他信號通路發生交匯對話(crosstalk)以及對TGF－β信號通路進行反饋調節的關鍵部位［10］。而在I－Smad中，并無典型的MH1結構，這正是I－Smad發揮抑制作用的結構基礎。位于Smad分子C端的MH2結構域有一特征性絲氨酸基序(SSXS motif)，可被TβRⅠ識別并磷酸化，介導了Smad分子與受體之間、Smad與Smad分子之間以及Smad分子與轉錄因子相互作用。

四、Smad分子介導的TGF－β信號轉導

1．TGF－β信號轉導的基本過程:TGF－β在細胞內以無活性的形式合成與分泌，無活性的TGF－β必須經過額外的刺激活化之后才能與TGF－β受體結合并表現出生物學活性。因為TβRⅠL45環(L45 Loop)和各R－Smad亞型L3環(L3 Loop)氨基酸序列的微小差異，TGF－β家族的信號通路可以分為明顯不同的兩條:TGF－β－活化素－nodal支(TGF－β－activin－nodal branch)，信號通過ALK4、ALK5、ALK7，激活下游的Smad2/3分子;骨形成蛋白－生長分化因子支(BMP－GDF－branch)，信號通過ALK1、ALK2、ALK3、ALK6激活下游的Smad1、Smad5和Smad8分子［11］。在TGF－β信號通路中，活化的TGF－β首先結合TβRⅡ，隨后與TβRⅠ二聚體形成活化的信號復合物，TβRⅡ激酶區引起TβRⅠ－GS結構域磷酸化并活化。活化的TβRⅠ與胞質內以同源寡聚體存在的Smad2/3分子短暫結合，使Smad2/3分子C端的SSxS基序中兩個絲氨酸殘基磷酸化而激活，并與Smad4結合形成異源六聚體進入胞核，作為轉錄因子單獨或與其他DNA結合蛋白共同激活特定靶基因的轉錄。完成轉錄之后，Smad復合物能夠解離，磷酸化R－Smads被細胞核內的磷酸酶(例如PPM1A/PP2C)脫去磷酸基，使這些R－Smads分子重新回到細胞質中，形成一個“Smad循環”［12］。

2．TGF－β信號轉導的調節

(1)TGF－β受體活化的調節:TGF－β受體活化過程中，磷酸化發揮了重要作用。TβRⅡ首先需要自身磷酸化其氨基酸殘基中Ser213、Ser409才能被組成性激活，其后與TβRⅠ相互作用并激活TβRⅠ［13］。在與TGF－β反應之后，TβRⅠ也能發生酪氨酸殘基的磷酸化［14］。除了磷酸化作用，胞質內的一些低分子蛋白質也對TGF－β受體活化具有重要調節效應。親免蛋白FKBP12是一種對TGF－β信號通路起負調控作用的胞質蛋白，其發揮抑制作用的機制是FKBP12能夠與TβRⅠ的GS結構域結合，覆蓋了TβRⅡ磷酸化位點并能穩定無活性的TβRⅠ結構。FKBP12亦能以一種活化素依賴的方式與Smad7相互作用，在TβRⅠ上形成FKBP12－Smad7復合物，因此FK-BP12可作為Smad7－Smurf1復合物的銜接蛋白促進TβRⅠ的泛素化降解［15］。STRAP可與TGF－β受體以及Smads2、3、7相互作用，它通過穩定Smad7與受體的結合，干擾Smad2/3與TβRⅠ結合，或者通過募集受體磷酸酶，從而在TGF－β信號通路中發揮負調控作用［16］。有資料證實，攜帶FYVE結構域的SARA (Smad anchor for receptor activation)通過將Smad2/3轉移給受體復合物，能夠促進TGF－β信號轉導［17］。SARA不僅可控制Smad2的亞細胞定位，還促進Smads2與TβRⅠ相互作用。熱休克蛋白90通過與Ⅰ、Ⅱ型受體的相互作用也參與了對TGF－β受體活化的正向調節過程［18］。另據報道，PPP家族的磷酸酶亦參與了TGF－β受體活化的調控［19］。PPP家族成員結構中包含有催化亞基和高度可變的調節亞基，因此代表了幾百種蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶的活性。PPP家族成員中蛋白磷酸酶1(PP1c)是對Dpp信號通路產生負調控效應的調節因子。PP1c通過一特殊的基序結合到SARA上并定位于Dpp受體復合物，干擾PP1c與SARA的相互作用從而導致DppⅠ型受體的磷酸化水平增高。在TGF－β信號途徑中，Smad7可與GADD34(growth arrest and DNA damage protein)相互作用，GADD34是人類PP1全酶的調節亞基。Smad7－GADD34復合物能募集PP1的催化亞基對TβRⅠ產生去磷酸化作用，在TGF－β信號通路中發揮負反饋作用［20］。Smad7介導的TβRⅠ去磷酸化作用是TGF－β信號通路有效的負反饋機制。

(2)R－Smad的調節:TβRⅠ對R－Smad分子C端SSXS基序的磷酸化是R－Smad分子活化的關鍵步驟，在細胞核中，主要通過兩種機制調節R－Smad的功能:磷酸酶介導的去磷酸化作用以及泛素依賴的R－Smad降解。PPM1A/PP2Cα是Smad2/3 SSXS基序特異性磷酸酶。PPM1A過表達取消了TβRI組成性激活誘導的Smad2/3磷酸化作用，而shRNA介導的PPM1A沉默延長了Smad2/3 SSXS基序磷酸化的持續時間。而且，PPM1A結合到磷酸化Smad2/3上，協助去磷酸化Smad2/3從胞核轉運至胞質［12］。最近，有資料證實，PTEN作為PPM1A的輔助因子參與了TGF－β信號通路的負反饋調節。PTEN主要通過與PPM1A形成一穩定的復合物，避免TGF－β誘導的PPM1A降解。因此，PTEN通過穩定PPM1A促進Smad2/3的去磷酸化效應。

除了磷酸酶，R－Smad還受到泛素－蛋白水解酶復合體通路(UPP)的調控。Smurf1，Smurf2以及相關的NEDD4－2都是E3泛素連接酶亞家族的成員，參與了TβRⅠ及R－Smad的泛素化和降解。爪蟾與人的Smurf1之間有91%的同源性，優先與Smad1、5連接區域的PPXY結構域結合，獨立誘導Smad1、5的泛素化和降解。Smurf2可與Smad1、2結合，但不與Smad4結合，優先與核內磷酸化的Smad2結合并介導其降解。Smad3還能與Smurf2和NEDD4－2結合，但Smad3并不能夠被這些HECT類的E3泛素連接酶降解。另有研究表明，Smurf2可下調Smad1、2表達水平，但不影響Smad3的表達。Smad2在核內的聚集最終導致其多聚泛素化以及隨后被蛋白水解酶復合體所降解。Smurf2也可通過Smad7與TGF－β受體復合物結合，進而引起受體和Smad7的降解。Smad2－Smurf2復合物還能誘導SnoN的降解，該過程受到后期促進因子(anaphase－promoting complex，APC)和UbcH5泛素偶聯酶(E2)的介導。

(3)I－Smad對TGF－β信號通路的調節:ISmad包括Smad6、7，其結構不同于R－Smad和Co－Smad，它們具有獨特的MH1結構域，并且缺乏C末端的磷酸化位點。Smad6、7是TGF－β/BMP信號通路負反饋環的關鍵調節因子。它們能通過競爭性抑制，與TβRⅠ形成穩定的復合物，抑制R－Smad的磷酸化;或者通過募集E3泛素連接酶(Smurf1/2)，造成TβRⅠ的泛素化降解。另外，Smad6、7能與轉錄抑制因子相互作用，或干擾R－Smad－DNA復合物的形成，從而在細胞核內抑制TGF－β/BMP信號轉導。

五、TGF－β信號轉導的非Smad途徑

除了經典的TGF－β/Smad信號通路，TGF－β還能以非Smad信號途徑的方式激活MAPK信號通路、Rho樣GTPase信號通路和PI3K/Akt信號通路。

在受體酪氨酸激酶(RTK)/Ras/胞外信號調節激酶(ERK)信號轉導中，TGF－β與RTK結合可誘導RTK的二聚體化并激活，進一步引起RTK胞質部分的多個酪氨酸殘基磷酸化。這些磷酸化的酪氨酸殘基能夠作為具有SH2或PTB結構域的信號分子(例如Src和Grb2)的結合位點。Grb2作為銜接蛋白，在沒有配體刺激的情況下在胞質中與Sos結合。RTK活化后，Grb2/Sos復合物經由Grb2的SH2結構域或通過另外一個銜接蛋白Shc，與RTK的酪氨酸殘基作用，Sos催化GDP生成GTP活化了Ras，活化的Ras與Raf結合，從而激活包括MEK和ERK在內的MAPK級聯反應。TGF－β除了通過RTK/Ras/ERK激活MAPK信號途徑，還可經由TRAF6－TAK1－ JNK/p38激活MAPK信號轉導過程。MAPK活化后再激活一系列蛋白分子(主要是細胞核內的轉錄因子)，對細胞的生存、分化、增殖及凋亡等方面發揮重要調控作用。此外，TGF－β通過Par6－Smurf1－RhoA激活Rho樣GTPase信號通路，或通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，在上皮向間質過度、成纖維細胞增殖以及形態改變等方面發揮一定作用。

六、TGF－β信號通路和其他信號途徑之間的交匯對話

TGF－β信號通路雖然簡單，但對生物體多種生命過程的調節卻是必不可少的。除了經典的TGF－β/Smad信號通路之外，TGF－β還能以細胞類型依賴的方式與其他的信號途徑(例如MAPKs，PI3K/ Akt，RhoA/Cdc42等)產生交匯對話，使TGF－β信號轉導更具有復雜性、多樣性和可調控性。

1．TGF－β信號通路與MAPK通路之間的交匯對話:研究證實，Smad蛋白的連接區是RTK/MAPK信號通路與TGF－β信號通路發生整合的關鍵平臺。Smad蛋白的連接區結構上連接松散，并高度可變，使它很容易與各種蛋白激酶接近。該連接區富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸殘基，并能優先地被脯氨酸定向的蛋白激酶(例如MAPKs和GSK3－β)磷酸化。最近發現Smad3連接區的3個氨基酸殘基(Thr178，Ser203和Ser207)是ERK1/2磷酸化的位點，ERK介導這些位點的磷酸化抑制了Smad3的轉錄活性，但對Smad3進入細胞核卻并沒有影響。GSK3－β結構與MAPKs相似，能選擇性地磷酸化Smad3連接區的Ser203。GSK3－β對Smad3連接區的磷酸化似乎并不影響Smad3的定位或活性，GSK3－β在TGF－β信號轉導過程中的作用還有待證實。MAPKs(尤其是ERK1/2)可磷酸化Smad1/5的連接區，幾乎完全阻斷Smad1/5的核轉位。Smad1/5連接區的多個絲氨酸/蘇氨酸殘基被ERK和GSK3－β磷酸化，形成Smad1/5特異性E3泛素連接酶Smurf1的錨定位點。Smurf1與Smad1/5連接不僅誘導Smad1/5的泛素化降解，還封閉了它們與核孔復合體的相互作用，因此阻止Smad1/5的核轉錄［10］。MAPKs對Smad2/3和Smad1/5作用的差異可能緣于它們的連接區氨基酸序列不同所致。

2．TGF－β信號通路與PI3K/Akt信號通路的交匯對話:PI3K/Akt信號轉導可抑制TGF－β介導細胞凋亡和細胞周期停滯，有趣的是，Smad3而非Smad2才是PI3K/Akt抑制的主要對象。PI3K/Akt對Smad3的抑制反應主要通過3種機制:①PI3K/Akt經TGF－β受體調節Smad3的活化;②PI3K活化后通過錨定在質膜上的Akt“扣留”Smad3，從而阻斷Smad3的核轉位;③PI3K/Akt通過下調Smad3發揮功能所必須的核因子發揮對Smad3的抑制功能。值得注意的是，PI3K/Akt信號轉導過程亦受到TGF－β的調節。例如，TGF－β活化時使Akt活性增加，從而使TGF－β信號通路與PI3K/Akt信號途徑之間的交匯對話更具有雙向性。

七、展望

業已明確，TGF－β是調節各種細胞生理過程的重要細胞因子，參與了諸如細胞增殖、分化、凋亡、黏附和遷移等多方面功能的調節。TGF－β信號通路在不同水平受到精密的調控，其調節功能障礙與人類多種疾病的發生密切相關。Smad蛋白作為TGF－β信號轉導中關鍵的信號分子，對維持細胞的正常功能發揮重要作用。除了Smad蛋白，TGF－β信號途徑還以非Smad蛋白的方式參與細胞功能的調節。另外，TGF－β信號通路還與其他的信號途徑之間存在交匯對話，使TGF－β信號通路更具有復雜性、多樣性和可調控性。由于TGF－β具有廣泛的生理作用與病理效應，因此深入了解其確切信號轉導環節、Smad蛋白功能以及與其他信號通路間的相互作用，進而精確控制TGF－β的功能，這對于實現在分子水平干預人類多種疾病的目的具有重要意義。

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(收稿:2012－02－22)

國家自然科學基金資助項目(30971192，81130035，81071545);國家重點基礎研究發展計劃基金項目資助(2012CB518102)

100048北京，解放軍總醫院第一附屬醫院全軍燒傷研究所(秦慶華、姚詠明);510515廣州，南方醫科大學基礎醫學院(秦慶華)

姚詠明，教授，博士生導師，電子信箱:c_ff@sina．com