超氧化物歧化酶(Val16Ala)基因的克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建

王 華，王九輝，譚光宏

(海南醫(yī)學(xué)院海南省熱帶病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571199)

·論 著·

超氧化物歧化酶(Val16Ala)基因的克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建

王 華，王九輝*，譚光宏

(海南醫(yī)學(xué)院海南省熱帶病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571199)

目的 獲得錳超氧化物歧化酶(MnSOD)基因并進(jìn)行Val16Ala(GTT→GCT)位點(diǎn)的定點(diǎn)突變，構(gòu)建MnSOD(Val)及MnSOD(Ala)基因的真核表達(dá)載體。方法 采用RT-PCR法從人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中擴(kuò)增MnSOD(Val)基因；PCR引物延伸法對Val16Ala進(jìn)行定點(diǎn)突變以獲得MnSOD(Ala)基因；通過EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物與相應(yīng)質(zhì)粒pEGFP-N1連接構(gòu)建兩基因的真核表達(dá)載體pEGFP-N1-MnSOD(Val)和pEGFP-N1-MnSOD(Ala)。結(jié)果 突變位點(diǎn)經(jīng)測序證明正確，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切及測序鑒定證明正確。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)成功獲得了MnSOD(Val)及MnSOD(Ala)基因并成功構(gòu)建了兩基因的真核表達(dá)載體。

MCF-7；MnSOD；Val16Ala；真核表達(dá)載體

錳超氧化物歧化酶(MnSOD)是位于線粒體內(nèi)的抗氧化酶，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)ROS水平影響乳腺癌的進(jìn)展及多種抗癌藥物的效應(yīng)。MnSOD的Val16Ala基因多態(tài)性具有功能性改變且發(fā)生頻率高，與乳腺癌的發(fā)生及預(yù)后相關(guān)。為了分析Val及Ala兩等位基因過表達(dá)后對乳腺癌細(xì)胞MCF-7功能及基因表達(dá)的差異以及化療藥物敏感性的差異，本研究在獲得MnSOD基因野生型的基礎(chǔ)上，首先對MnSOD基因進(jìn)行第16位氨基酸的點(diǎn)突變，即GTT突變?yōu)镚CT，然后構(gòu)建了MnSOD(Val)及MnSOD(Ala)基因的真核表達(dá)載體，以期為進(jìn)一步研究Val16Ala多態(tài)性對乳腺癌進(jìn)展及化療敏感性的影響打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與質(zhì)粒 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。攜帶EGFP基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 藥品與試劑 細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM及胎牛血清FBS購自GIBCO公司，0.25%胰蛋白酶購自AMESCO公司；RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；ExTaq、T4DNA連接酶、EcoRⅠ、XhoⅠ及DL2000DNA Marker均購自TAKARA公司；所用引物根據(jù)GeneBank中序列號為NM_000636的cDNA序列(669bp)設(shè)計(jì)并均由上海生工合成；PCR產(chǎn)物純化試劑盒QIAquick PCR Purification Kit、膠回收試劑盒MinElute Reaction Cleanup Kit均購自QIAGEN公司。DNA Ladder購自碧云天生物技術(shù)研究所。所用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) DMEM培養(yǎng)液含10%FBS，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RT-PCR 采用TRIzol裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，兩步法擴(kuò)增MnSOD cDNA全長基因。首先，逆轉(zhuǎn)錄按20μL體系進(jìn)行。體系中含RNA樣品11μL、Oligo dT(18)2μmol/L，于65℃保溫5min，然后冰浴5min；隨后往上述體系中依次加入RNase抑制劑(40U/μL)0.5μL、10×AMV 反應(yīng)緩沖液 2μL、dNTP(10μmol/L)2.5μL及AMV逆轉(zhuǎn)錄酶2μL，輕輕混勻后于42℃水浴1h，再于70℃水浴15min終止反應(yīng)，產(chǎn)物存于-20℃。擴(kuò)增MnSOD cDNA全長基因所用引物為P1(TCAGAT CTCGAG ATGTTGAGCCGGGCAGTGT，1～19bp)、P2(CTGCAGAATTC CTTTTTGCAAGCCATGTATC，647～666bp)。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min；94℃ 40s，51℃ 1min，72℃ 1min，30個循環(huán)；72℃延伸5min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。此時獲得的基因型為MnSOD(Val)。

1.2.3 Val16Ala點(diǎn)突變 Val16Ala點(diǎn)突變即為編碼Val的密碼子GTT點(diǎn)突變?yōu)榫幋aAla的密碼子GCT。以上述MnSOD(Val)基因RT-PCR產(chǎn)物純化后為模板，P4(CAGC AGGCAGCTGG CTCCGGCTTTGGG，27～53bp，紅色標(biāo)記處為突變位點(diǎn))與P2為引物做PCR，對MnSOD(Val)基因進(jìn)行點(diǎn)突變；第一次PCR產(chǎn)物純化后作為模板，以P3(CC GGGCAGTGTG CGGCACCAGC AGGCAG，8～36bp)與P2為引物做PCR，即延伸反應(yīng)；再將第二次PCR產(chǎn)物純化后作為模板，P1與P2為引物做第二次延伸反應(yīng)，以獲得全長的MnSOD(Val16Ala)點(diǎn)突變序列。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃ 40s，55℃ 1min，72℃1min，28個循環(huán)；72℃延伸6min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。此時獲得的基因型為MnSOD(Ala)。

1.2.4 載體構(gòu)建 取上述純化的PCR產(chǎn)物[Mn-SOD(Val)、MnSOD(Ala)]，分別用EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切，并同時雙酶切真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1。酶切產(chǎn)物切膠回收后于16℃連接過夜，連接產(chǎn)物經(jīng)CaCl2法轉(zhuǎn)化宿主菌NovaBlue，并以卡那霉素作為抗性篩選標(biāo)記。堿裂解法小量提取質(zhì)粒并用EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。本試驗(yàn)中所有DNA重組操作均按《分子克隆試驗(yàn)指南》第3版[1]的方法進(jìn)行。

1.2.5 突變位點(diǎn)的鑒定 取上述實(shí)驗(yàn)篩選出來的陽性克隆樣品菌液，送測序，測序引物為GGAGGTCTATATAAG(該序列位于質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)上游部分)。

2 結(jié) 果

2.1 電泳結(jié)果 MnSOD(Val)、MnSOD(Ala)基因的獲得PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1，所得產(chǎn)物在669bp處，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。

圖1MnSOD基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建 MnSOD(Val)、Mn-SOD(Ala)型基因分別與載體pEGFP-N1連接、轉(zhuǎn)化，EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。鑒定結(jié)果如圖2所示：已獲得兩種基因型的重組質(zhì)粒。

圖2 重組質(zhì)粒的EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 突變位點(diǎn)的鑒定 取上述結(jié)果中1號樣品與6號樣品菌液送測序，測序結(jié)果經(jīng)生物學(xué)軟件DNAMAN比對以檢查其突變位點(diǎn)。比對結(jié)果見圖3，Mn-SOD(Ala)基因型中的GTT已經(jīng)成功突變?yōu)镚CT，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。測序結(jié)果也證明了載體構(gòu)建是正確的。

圖3DNAMAN比對結(jié)果

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其風(fēng)險(xiǎn)因素包括年齡、家族史、生育、月經(jīng)史以及肥胖等。近年來發(fā)現(xiàn)錳超氧化物歧化酶(MnSOD)基因的Val16Ala多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)生及預(yù)后具有相關(guān)性。MnSOD在線粒體內(nèi)發(fā)揮對氧自由基的清除作用，是一種非常重要的抗氧化酶。該基因敲除的小鼠表現(xiàn)出線粒體的功能紊亂，并產(chǎn)生致命后果，相反，過表達(dá)MnSOD則對線粒體有保護(hù)作用[2]。MnSOD基因的Val16Ala多態(tài)性位于信號肽的第16位氨基酸處，其在將Mn-SOD靶向定位于線粒體中起關(guān)鍵作用。信號肽16位氨基酸為Ala時線粒體中的MnSOD含量明顯高于Val存在時的含量[3]。

有研究表明，乳腺癌的進(jìn)展與體內(nèi)ROS和抗氧化系統(tǒng)的平衡失調(diào)有關(guān)[4]。ROS是一種重要的信號分子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、轉(zhuǎn)化及凋亡，但過高的ROS可對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[5]。MnSOD通過調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)的ROS水平，防止細(xì)胞收到氧化壓力的損傷，從而對腫瘤的病理生理過程產(chǎn)生影響。另外，MnSOD表達(dá)水平的變化還可導(dǎo)致抗癌藥物療效及不良反應(yīng)的差異。例如，抑制MnSOD表達(dá)可提高卵巢癌細(xì)胞對阿霉素和紫杉醇的敏感性；阿霉素與重組MnSOD聯(lián)合用藥可提高對乳腺癌細(xì)胞和小鼠實(shí)體瘤的療效；MnSOD水平升高可使消化道腫瘤細(xì)胞對阿霉素和絲裂霉素C的敏感性下降；MnSOD對阿霉素的心臟毒性具有保護(hù)作用等[6-9]。因此，明確MnSOD基因的Val16Ala多態(tài)性對乳腺癌進(jìn)展及化療敏感性的影響意義重大。本研究在成功獲得突變體的基礎(chǔ)上構(gòu)建了MnSOD(Val)及MnSOD(Ala)基因的真核表達(dá)載體pEGFP-N1-MnSOD(Val)和pEGFP-N1-Mn-SOD(Ala)，以期在MCF-7細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)后為進(jìn)一步研究Val16Ala多態(tài)性對乳腺癌進(jìn)展及化療敏感性的影響打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1]薩姆布魯克.J,拉塞爾DW,著.黃培堂譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].3版.北京:科學(xué)出版社,2002:93-96.

[2]Strassburger M,Bloch W,Sulyok S,et al.Heterozygous deficiency of manganese superoxide dismutase results in severe lipid peroxidation and spontaneous apoptosis in murine myocardium in vivo[J].Free Radic Biol Med,2005,38(11):1458-1470.

[3]Shimoda-Matsubayashi S,Matsumine H,Kobayashi T,et al.Structural dimorphism in the mitochondrial targeting sequence in the human manganese superoxide dismutase gene[J].Biochem Biophys Res Commun,1996,226(2):561-565.

[4]Ambrosone CB.Oxidants and antioxidants in breast cancer[J].Antioxid Redox Signal,2000,2:903-917.

[5]Monteiro HP,Stern A.Redox modulation of tyrosine phosphorylation-dependent signal transduction pathways[J].Free Radic Biol Med,1996,21(3):323-333.

[6]Yeung BH,Wong KY,Lin MC,et al.Chemosensitisation by manganese superoxide dismutase inhibition is caspase-9dependent and involves extracellular signal-regulated kinase 1/2[J].Br J Cancer,2008,99(2):283-93.

[7]Chaiswing L,Cole MP,Ittarat W,et al.Manganese superoxide dismutase and inducible nitric oxide synthase modify early oxidative events in acute adriamycin-induced mitochondrial toxicity[J].Mol Cancer Ther,2005,4(7):1056-1064.

[8] Chen CS,Zhao Q,Wang J,et al.Enhanced anti-tumor effects achieved in a murine tumor model using combination therapy of recombinant human manganese superoxide dismutase and adriamycin[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,370:663-668.

[9]Sun W,Kalen AL,Smith BJ,et al.Enhancing the antitumor activity of adriamycin and ionizing radiation[J].Cancer Res,2009,69(10):4294-4300.

Cloning of manganese superoxide dismutase gene(Val16Ala)and the construction of its eukaryotic expression vector.

WANG Hua,WANG Jiu-hui*,TAN Guang-hong.Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Medicine,HainanMedical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA

Objective To clone manganese superoxide dismutase gene(MnSOD)and the site-directed mutation for Val16Ala(GTT→GCT),then construct eukaryotic effective expression vector with the two genotypes.Methods Firstly,we cloned gene MnSOD(Val)from the total RNA of human breast carcinoma cells MCF-7by RT-PCR and the site-directed mutated mutation for Val16Ala(GTT→GCT)by overlap extension using PCR to acquire genotype MnSOD(Ala).Secondly,the two genotypes digested byEcoRⅠ andXhoⅠ,and then ligated to expression vector pEGFP-N1to construct the plasmid pEGFP-N1-MnSOD(Val)and pEGFP-N1-MnSOD(Ala).Results Mutation site were proved correctly by sequencing,and the recombinant vectors were proved to contain the expected inserts by double digestion with restriction enzymes and sequencing.Conclusion Two genotypes MnSOD(Val)and MnSOD(Ala)have been cloned,and two eukaryotic expression vectors containing the two genes have been constructed successfully.

MCF-7;MnSOD;Val16Ala;Eukaryotic expression vectors

R394

A

1003—6350（2012）16—001—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.16.001

國家自然科學(xué)基金(編號：81060276)

王 華(1980—)，女，重慶市人，助理研究員，碩士。*

王九輝，副教授。E-mail：wangjh3@tom.com

2012-05-08)