韓瀟瀟 陳穎鈺 郭愛珍 *

1.華中農業大學動物醫學院，武漢 430070；2.華中農業大學動物科技學院，武漢 430070；3.華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室，武漢 430070

牛支原體是一種能夠引起肉牛和奶牛多種疾病的重要病原體，也是牛呼吸道綜合癥的重要病原體之一。牛支原體除了導致肺炎、乳腺炎外，還可導致關節炎、角膜結膜炎、耳炎、生殖道炎癥、流產與不孕等多種疾病[1]。在臨床病例中牛支原體引起的疾病沒有典型癥狀，且常常與其他多種致病菌混合感染，與其他疾病難以區分，所以極易被忽視。自l961年在美國首次分離到支原體以來[2]，全世界大多數國家都已經發生過牛支原體相關疾病的疫情；我國在2008年也首次報道了牛支原體肺炎的疫情，發病率為50%～100%，病死率高達10%～50%，造成了巨大的經濟損失[3-4]。

1 病原學

牛支原體屬于柔膜體綱支原體目支原體科支原體屬，是一類缺乏細胞壁、具有高度形態多樣性、可通過濾菌器并能在無生命培養基中生長繁殖的最小的原核細胞型微生物[5]；牛支原體基因組大小為1080kb，G+C含量為27.8%～32.9%，牛支原體和牛無乳支原體基因組非常相似，在16SrRNA上有99%的同源性[1]。

牛支原體一般寄生在黏膜表面，主要寄生于鼻腔，其次在乳腺。牛支原體在環境中的存活力較其他支原體稍強，如在避免陽光直射條件下可存活數周，在4℃牛奶和海綿中可存活2個月；在水中可存活2周以上；在20℃時，其存活時間降至1～2周，在37℃時其存活時間降為1周；牛支原體在65℃2min、70℃ 1min可滅活；但4～37℃范圍內在液體介質中可存活59～185d；在其他材料中的存活時間是：糞 37d，棉 18d，秸稈 13d，木和不銹鋼 1～2d[6]。

2 流行病學

牛支原體自然感染的潛伏期較難確定。國外有報道，在健康犢牛群中引入感染牛24h后，就有犢牛從鼻腔中排出牛支原體，但大部分牛在接觸感染牛7d后經鼻腔排出牛支原體。有的牛在接觸感染牛2周后發病[3]。我國牛支原體病的暴發幾乎都與運輸有關，多數牛在運輸到目的地后1周左右發病，如在途中遭遇雨淋等不良環境影響，牛可在運達目的地后第2天即發病。感染牛支原體的牛可攜帶病原體數月甚至數年而成為一個傳染源。主要傳播途徑是通過飛沫經呼吸道傳播，近距離接觸、吮吸乳汁或生殖道接觸等也可傳播牛支原體[7]。

牛支原體通常和其他病原體混合感染。常見的混合感染細菌有多殺性巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌、溶血性曼氏桿菌和昏睡嗜血桿菌。常見的混合感染病毒有牛皰疹病毒l型或牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛冠狀病毒和牛呼腸孤病毒等[6]。這些病毒可誘導免疫抑制，促使細菌性病原增殖并下行至肺，引發肺炎。

異地運輸、飼養方式或環境條件改變等應激因素是牛支原體肺炎的誘發因素，同時牛支原體感染對機體免疫系統造成極大破壞，也進一步促進繼發感染或混合感染的病原微生物的致病作用。除細菌和病毒的混合感染外，血孢子蟲感染可能對牛支原體肺炎的發生也有促進作用[3]。

3 臨床癥狀和病理變化

牛支原體感染牛只后，往往會引起慢性肺炎癥狀，病程較長，發病初期體溫升高至42℃左右，病牛精神沉郁、食欲減退、咳嗽、氣喘、清晨、半夜或氣溫轉涼時咳嗽劇烈，有清亮或膿性鼻汁，嚴重者食欲廢絕，病程稍長時患牛明顯消瘦，被毛粗亂無光；有的患牛繼發腹瀉，糞呈水樣或帶血；有的患牛繼發關節炎，表現跛行、關節膿腫等癥狀；也有病牛繼發結膜炎，眼結膜潮紅，有大量漿液性或膿性分泌物。嚴重者出現死亡，犢牛病情相對嚴重，病死率可達50%[3，6]。

剖檢病理變化主要集中在胸腔與肺部。肺和胸膜發生不同程度粘連，有少量積液；心包積水，液體黃色澄清；肺發生不同程度地病變，可能與病程及機體抵抗力有關。輕者可見肺尖葉、心葉及部分膈葉的局部紅色肉變，或同時有化膿灶散在分布；嚴重者可見肺部廣泛分布有干酪樣或化膿性壞死灶。病理組織學觀察可見支氣管肺炎或化膿性壞死性肺炎，或凝固性壞死性肺炎[3，6]。

4 診斷方法

4.1 病原體的分離鑒定

按照無菌操作規程將小塊組織樣本涂于類胸膜肺炎微生物（PPLO）和適當抗生素的固體培養基表面，于體積分數為5%的CO2培養箱中，同時將小塊組織樣本投入到PPLO液體培養基中。2～3d后在光學顯微鏡下低倍觀察菌落形態，支原體菌落應具有“煎蛋樣”典型特征，液體培養基由紅色變為黃色且透亮[6]。

4.2 基因檢測

牛支原體基因檢測方法主要是PCR方法。由于牛支原體和牛無乳支原體同源性很高，所以僅僅使用PCR檢測16SrRNA的擴增片段無法區分牛支原體和牛無乳支原體，需要使用RT-PCR、雜交探針和解鏈溫度分析等輔助才可以快速靈敏地區分這2種病原。此外，PCR擴增16SrRNA后，再進行變性梯度凝膠電泳也可以快速鑒別出這2種病原[8]。根據牛支原體特異性基因UvrC建立的環介導等溫核酸擴增檢測（LAMP）方法，具有較高的特異性和靈敏性，為牛支原體的快速診斷提供了方法[9]。

4.3 血清學檢測

牛支原體血清學檢測方法包括間接血凝試驗、生長抑制試驗、間接酶聯免疫吸附試驗等，用處理過的牛支原體全菌蛋白作包被抗原的間接ELISA是當今最主要的血清學檢測方法。在歐洲等國家已有商業化的ELISA試劑盒出售，其敏感性和實效性都比傳統的培養方法好得多，可用該法評價牛支原體血清抗體陽性率和建立無牛支原體感染牛場[10]。一種針對牛支原體全菌裂解物的單克隆封閉抗體作為目標抗原的封閉ELISA方法，在檢測牛支原體血清抗體時具有高度特異性、敏感性、較少的背景干擾和交叉反應[11]。

4.4 免疫組化

免疫組化是一種敏感、特異的鑒定病原的方法，該方法主要優點在于可以檢測到支原體抗原在體內的分布情況；特別是在其他方法表明牛支原體存在，但病原培養又為陰性時，免疫組化就顯得更為重要[12]。在干酪樣壞死性支氣管肺炎的組織損傷中，免疫組化結果表明牛支原體抗原遍布于干酪樣壞死灶處，但是在壞死灶周圍尤其顯著；抗原主要在巨噬細胞的胞漿內，在壞死物質中沒有。抗原同時也存在于肺泡和支氣管腔內的巨噬細胞、嗜酸性細胞和中性粒細胞內[13]。

5 疫苗研究進展

雖然牛支原體是引起犢牛肺炎、乳腺炎和關節炎的主要致病菌，但目前還沒有特別有效的牛支原體疫苗[1]。由于牛支原體對抗生素的敏感性較差，所以使用疫苗預防將會是一種較為理想的控制方法。但目前除美國外，幾乎沒有商業化疫苗用于牛支原體病的預防，一些商業化的疫苗（包括2株預防牛肺炎的疫苗Pulmo-GuardTMMpB和Myco-BacTM B，1株預防乳腺炎的疫苗 MycomuneTM）雖已在美國應用，但沒有任何文獻報道可以說明這些疫苗是否有效。在歐洲，一種包括牛支原體在內的四價滅活苗可以提供一定的預防效果。另一種有高免疫源性的皂苷滅活疫苗可以對攻毒后動物提供較高的保護力，免疫后的牛臨床癥狀較輕微，體溫、肺部病變、體重消長等指標與未免疫牛有較顯著差異，且免疫牛對支原體在體內的擴散有一定的抑制作用[14]。所以就目前看來，牛支原體還缺乏一種真正的商業化疫苗來防止該病的發生。

6 綜合防制措施

6.1 治療

“早診斷，早治療”是有效控制本病的基本原則。有牛場證實在牛群引進后立即進行全群治療，可明顯降低發病率和死亡率。早期應用抗生素治療牛支原體病有一定效果，但應保持足夠用藥量和用藥療程[15]。牛支原體無細胞壁，對作用于細菌細胞壁的β-內酰胺酶類抗菌藥物（如青霉素和頭孢類藥物）不敏感，因此應選用作用于細菌蛋白質合成的相關藥物。另外，牛為反芻動物，藥物內服效果相對較差。實驗室藥敏試驗結果證實牛支原體的敏感抗生素有四環素類、替米考星或壯觀霉素等。牛支原體對喹諾酮類藥物（如環丙沙星、泰樂菌素類藥物）也敏感。但臨床用藥經常與實驗室結果出現差異，這可能與牛支原體耐藥性、混合感染、病程等多種因素有關[3]。

6.2 預防

1）加強牛群引進管理和檢疫。不從疫區或發病區引進牛，盡量減少遠距離運輸，減少交易環節。牛群引進前應做好牛支原體病、牛結核、泰勒蟲病等病的檢疫檢測，防止引進病牛或處于潛伏感染期的帶菌牛。在產地完成預防接種，防止引進病牛和帶菌牛。牛群引進后應進行隔離觀察，確保無病后方可與健康牛混群，定期對牛群進行血清學檢查以便及時掌握本病在牛群中的流行情況。在有條件的情況下，進行“自繁自養”，這是控制疾病流行的較好方法。育肥牛群采用全進全出制度，在空欄期要對牛舍進行徹底消毒。

2）加強牛只的飼養管理，減少環境應激。保持牛舍通風良好、清潔、干燥。牛群密度適當，避免過度擁擠。不同年齡及不同來源的牛應分開飼養。適當補充精料與維生素及礦物元素，保證日糧的全價營養。確保犢牛至少在運輸前30d斷奶，并已適應粗飼料與精飼料喂養。定期消毒牛舍，及時發現與隔離病牛，盡早診斷與治療。

7 結 語

牛支原體病是呈世界性分布的重要傳染病，尤其在養牛業發達的國家，這種疾病的發生更為嚴重，給養牛業造成了巨大的經濟損失。隨著我國牛養殖量的增加，飼養方式向規模化和集約化等現代養殖模式轉變，我國養牛業受該病的威脅也越來越大。現階段國內外對牛支原體研究不深入也不透徹，因此需要投入更多的人力、物力深入研究牛支原體病的免疫和致病機制，開發有效的診斷試劑及疫苗，有效防控牛支原體病，保障養牛業健康、快速發展。

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