應(yīng)用脂肪干細(xì)胞構(gòu)建小口徑組織工程血管平滑肌層的實(shí)驗(yàn)研究

崔 磊，雷萬(wàn)軍，楊建英

血管組織的缺損是臨床上常見(jiàn)的外科疾病之一。目前臨床上大多采用自體移植、異體移植以及人工合成替代品移植技術(shù)來(lái)修復(fù)這些缺損，但這些方法各有其缺點(diǎn)，很難滿足臨床上血管缺損修復(fù)的需要[1-2]。組織工程學(xué)的產(chǎn)生為血管病變的修復(fù)提供了一種新的途徑。由于脂肪干細(xì)胞(adipose derived stem cell，ASCs)具有來(lái)源廣泛、取材方便、對(duì)供體損傷小、體外增殖能力強(qiáng)且不受年齡的影響等特點(diǎn)[3-4]，而備受人們的關(guān)注，用作組織工程血管構(gòu)建的種子細(xì)胞。同時(shí)，我們的前期實(shí)驗(yàn)也證明，在應(yīng)用能模擬體內(nèi)血流循環(huán)、血管搏動(dòng)的裝置—血管生物反應(yīng)器的作用下，可以產(chǎn)生具有一定力學(xué)強(qiáng)度的組織工程化血管平滑肌層[5-6]。本實(shí)驗(yàn)就在此研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用人ASCs作為種子細(xì)胞，在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)的作用下，向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并應(yīng)用生物反應(yīng)器在體外構(gòu)建組織工程化血管組織。

1 材料和方法

1.1人脂肪干細(xì)胞(hASC)的分離、培養(yǎng)脂肪組織來(lái)源于上海第九人民醫(yī)院整復(fù)外科脂肪抽吸術(shù)患者，均為女性，平均年齡30歲。根據(jù)Zuk[7]的方法進(jìn)行，簡(jiǎn)言之：無(wú)菌PBS沖洗脂肪，用0.075%I型膠原酶(Sigma-Aldrich)在37℃搖床中消化60 min后，加同體積含10%FBS (Gibco公司)的低糖DMEM培養(yǎng)液終止消化，1 200 g離心10 min，小心吸除上層脂肪油層和大部分上清，50 μm濾網(wǎng)過(guò)濾離心成分，再600 g離心10 min，去除上清，用含10%FBS的LG-DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以4.0×104細(xì)胞/cm2接種于直徑100 mm培養(yǎng)皿中，24 h后去除非貼壁細(xì)胞，之后每隔3 d換液，細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，常規(guī)傳代，第4～6代的細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.2人脂肪干細(xì)胞(hASC)向平滑肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化當(dāng)hASCs達(dá)50%～60%融合時(shí)，分不同組加入如下不同的培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)觀察：①LG-DMEM+10%FBS(正常培養(yǎng)液)， ②LG-DMEM+1%FBS(BM)，③LG-DMEM+1%FBS+5 ng/mlTGF-β1(R&DSystems)，④LG-DMEM+1%FBS+2.5 ng/mL BMP4(R&DSystems)，⑤LG-DMEM+1%FBS+2.5 ng/mLBMP4+5 ng/mLTGF-β1。人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(hUASMCs)作為陽(yáng)性對(duì)照。每2 d換液1次，共誘導(dǎo)7 d。

1.3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的檢測(cè)將在上述不同培養(yǎng)液中的細(xì)胞分1、3、5、7和10 d 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)以DNA定量的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)。即以0.5 mg/mL的蛋白酶K溶解消化細(xì)胞，每孔0.5 mL，56℃過(guò)夜。離心(1 200 r/min)后洗去40 μL上清與160 μL Hoechst33258染液混合，移入黑色平底96孔板中，避光37℃孵化20 min，以全波段酶標(biāo)儀檢測(cè)360 nm熒光強(qiáng)度(激發(fā)光波長(zhǎng)465 nm)。并以相同方法檢測(cè)確定細(xì)胞數(shù)的DNA的360 nm熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)熒光值得出所測(cè)樣本的細(xì)胞數(shù)。

1.4免疫熒光檢測(cè)用乙醇∶冰醋酸(99∶1)固定細(xì)胞或組織切片15min，PBS漂洗；10%羊血清封閉30 min；加適當(dāng)稀釋的一抗：鼠單克隆抗α-SMA(Sigma-Aldrich)、SM-MHC (Sigma-Aldrich)，兔多克隆抗SM22α (Abcam)和兔單克隆抗calponin (Abcam)， 4℃過(guò)夜；PBS漂洗，滴加FITC標(biāo)記的相應(yīng)二抗，37℃孵育45 min，PBS漂洗；碘化丙啶(PI)襯核后，熒光顯微鏡下觀察。以臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照。

1.5 RT-PCR檢測(cè)用Trizol提取不同條件下誘導(dǎo)7 d的細(xì)胞內(nèi)總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)平滑肌特異性標(biāo)記物α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC的表達(dá)，反應(yīng)條件：95℃ 3 min變性，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。引物序列如表1。

表1 RT-PCR反應(yīng)引物序列

1.6 Western-blotting檢測(cè)用細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞或組織，獲取蛋白，將蛋白與2×上樣緩沖液混合后，SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將印跡后的PVDF膜用甲醇浸泡，加入封閉液(5%BSA，TBST),4°C封閉過(guò)夜。各一抗和β-actin加入膜上，4℃過(guò)夜，吸去一抗，加入IRDye 700 DX或IRDye 800 CW標(biāo)記的二抗，以O(shè)dyssey紅外圖像成像系統(tǒng)掃描成像，β-actin的表達(dá)作為各組細(xì)胞的內(nèi)參。

1.7 PGA膜片的制備及細(xì)胞-PGA復(fù)合物的體外培養(yǎng)將50 mg未編織的PGA纖維制作成55 mm×45 mm×2 mm大小的膜片，75%乙醇浸泡1 h ，紫外光照射30 min，用標(biāo)準(zhǔn)DMEM液浸泡過(guò)夜。收集hASCs 5×107細(xì)胞/mL，將1mL的細(xì)胞懸液接種于PGA材料上，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，黏附4 h后加入誘導(dǎo)液，體外培養(yǎng)皿中培養(yǎng)7 d，取細(xì)胞-PGA復(fù)合物同時(shí)做掃描電鏡觀察和DiO標(biāo)記細(xì)胞后的激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞在材料上的黏附情況。

1.8細(xì)胞-PGA復(fù)合物在生物反應(yīng)器內(nèi)的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)1周后，將細(xì)胞-PGA復(fù)合物卷裹于反應(yīng)器反應(yīng)槽內(nèi)的無(wú)菌硅膠管上(內(nèi)徑4 mm)，并用無(wú)菌可吸收縫線固定。動(dòng)態(tài)組：將其接于動(dòng)態(tài)槽內(nèi)接口，予以動(dòng)態(tài)力學(xué)刺激，參數(shù)設(shè)定為：搏動(dòng)頻率75次/min，擴(kuò)張量<5%，流量為70～80 mL/min至100～120 mL/min，壓力為0.01～0.02 mPa。每周換液1次，共培養(yǎng)8周。

1.9組織學(xué)檢測(cè)常規(guī)石蠟切片，分別做H&E染色、Masson三色染色和Gomori醛復(fù)紅染色觀察新生管樣組織的組織學(xué)特點(diǎn)、膠原分泌情況和彈性纖維的合成情況。

1.10生物力學(xué)檢測(cè)用INSTRON力學(xué)測(cè)定儀對(duì)構(gòu)建的組織的最大張力、彈性模量和縫線張力進(jìn)行測(cè)定。

1.11組織工程化血管膠原含量的測(cè)定將構(gòu)建的組織稱重，并用10∶1比例的胃蛋白酶進(jìn)行消化，振蕩過(guò)夜，根據(jù)Sircol Soluble Collagen Assay試劑盒，用分光光度儀測(cè)量540 nm處的光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定測(cè)定組織中總膠原的含量，用μg/g 濕重表示。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件(Student’st檢驗(yàn))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)P<0.05 時(shí)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)觀察hASC在正常培養(yǎng)液培養(yǎng)下細(xì)胞呈成纖維樣梭形生長(zhǎng)(圖1a)，在單純低血清培養(yǎng)液(BM)中呈扁平樣生長(zhǎng)(圖1b)，而在含有TGF-β1和/或BMP4的誘導(dǎo)液的作用下，細(xì)胞呈梭形生長(zhǎng)，與hUASMCs的生長(zhǎng)形態(tài)相似，呈平滑肌細(xì)胞特有的“波峰—波谷”樣生長(zhǎng)模式(圖1c～f)。其中尤其在TGF-β1和BMP4的聯(lián)合誘導(dǎo)作用下細(xì)胞形態(tài)變化更明顯，Phalloidin 染色(圖1)也顯示了細(xì)胞內(nèi)的肌絲與hUASMCs一致。

a:正常培養(yǎng)液中第5代hASCs的生長(zhǎng)形態(tài) b:無(wú)生長(zhǎng)因子的低血清培養(yǎng)液培養(yǎng)7 d c:單純TGF-β1誘導(dǎo)組 d:單純BMP4誘導(dǎo)組 e:TGF-β1和BMP4聯(lián)合誘導(dǎo)組 f:陽(yáng)性對(duì)照hUASMCs組(標(biāo)尺大小：a～f：100 μm,其中插圖標(biāo)尺大小：50 μm)。

2.2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線從圖2的生長(zhǎng)曲線可以看出，hASCs在正常培養(yǎng)液中持續(xù)生長(zhǎng)，而在其他組，無(wú)論是單純的低血清誘導(dǎo)組還是加有生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)組，細(xì)胞都出現(xiàn)了生長(zhǎng)停滯，說(shuō)明hASCs的生長(zhǎng)活性良好。同時(shí)，在加有生長(zhǎng)因子的情況下，細(xì)胞生長(zhǎng)停滯有利于細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化。

2.3 hASCs在TGF-β1和BMP4的作用下平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá)免疫熒光檢測(cè)可以看出，hASCs在TGF-β1和BMP4的聯(lián)合誘導(dǎo)作用下，表達(dá)平滑肌細(xì)胞的特異性蛋白：α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC。而在正常培養(yǎng)液組盡管可見(jiàn)α-SMA、SM22α的基礎(chǔ)表達(dá)，但在生長(zhǎng)因子的作用下，這兩個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)有明顯的提高，且只有在聯(lián)合誘導(dǎo)下，才有SM-MHC的表達(dá)，這一標(biāo)記物只在平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，從而證明在TGF-β1和BMP4的聯(lián)合作用下，hASCs分化成平滑肌樣細(xì)胞(圖3)。為了證明免疫熒光染色的結(jié)果，我們做了western-blot來(lái)觀察上述指標(biāo)在蛋白水平的表達(dá)情況，從圖4A 可以看出，α-SMA、SM22α在正常培養(yǎng)液和單純低血清組也有一定的表達(dá)，但只有在TGF-β1和BMP4的聯(lián)合誘導(dǎo)組，這些特異性蛋白的表達(dá)才與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)。這與熒光觀察的結(jié)果一樣。同時(shí)，為了進(jìn)一步證明TGF-β1和BMP4對(duì)hASCs的誘導(dǎo)分化作用，我們又做了RT-PCR來(lái)檢測(cè)這些平滑肌細(xì)胞相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況。從圖4B可以看出，未分化的hASCs 只表達(dá)低水平的α-SMA、SM22α mRNA、TGF-β1或BMP4，單純誘導(dǎo)組可見(jiàn)calponin的表達(dá)，而只有兩者聯(lián)合作用組才見(jiàn)SM-MHC的表達(dá)且與陽(yáng)性對(duì)照組相似。從而在蛋白和轉(zhuǎn)錄水平證明了在TGF-β1和BMP4的聯(lián)合作用下，hASCs分化成了平滑肌細(xì)胞。

A:不同組細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)變化 B:DNA定量法(Hoechst 33258染色)檢測(cè)hASCs在不同培養(yǎng)液中的增殖曲線

可見(jiàn)只有在TGF-β1和BMP4的聯(lián)合誘導(dǎo)作用下，誘導(dǎo)細(xì)胞才表達(dá)與hUASMCS相似的細(xì)胞骨架蛋白(綠色)，PI襯細(xì)胞核(紅色)。標(biāo)尺大小：25 μm，插圖：50 μm。

圖3 免疫熒光染色觀察hASCs在不同培養(yǎng)條件下作用7 d表達(dá)平滑肌細(xì)胞特異性蛋白(α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC)的情況

A:Western-blot分析α-SMA, SM22α、Calponin、SM-MHC和β-actin的表達(dá) B:RT-PCR觀察各蛋白的mRNA的表達(dá)

2.4細(xì)胞-PGA復(fù)合物的體外及生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞-PGA復(fù)合物在體外培養(yǎng)7 d，電鏡和激光共聚焦可見(jiàn)大量細(xì)胞黏附于材料上，并有大量的細(xì)胞外基質(zhì)分泌充填于PGA纖維間，且細(xì)胞分布于PGA膜片的各個(gè)部位 (圖5a～d)。隨著復(fù)合物在反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)，PGA材料逐漸降解，形成管樣組織(圖5e)。培養(yǎng)8周后，形成新生的組織工程化肌管組織。新生組織色澤光亮，質(zhì)地均勻，管腔圓潤(rùn)，具有一定的彈性和強(qiáng)度(圖5f)。

2.5組織學(xué)觀察反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)8周后，HE染色可見(jiàn)構(gòu)建組織結(jié)構(gòu)致密，平滑肌纖維排列規(guī)則，分布較均勻，PGA纖維已基本降解。Masson染色可見(jiàn)膠原分泌旺盛且濃密，肌纖維排列整齊，細(xì)胞分布規(guī)則，PGA已降解完全。但是未見(jiàn)彈性纖維的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)(圖6A)。同時(shí)我們對(duì)構(gòu)建的組織進(jìn)行免疫組化分析，可以看出細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)8周后仍然表達(dá)平滑肌細(xì)胞的標(biāo)記物，細(xì)胞分布均勻規(guī)則(圖6B)。

a:PGA支架材料大體觀 b:掃描電鏡觀察7 d時(shí)，PGA材料上有大量細(xì)胞黏附并伴細(xì)胞外基質(zhì)分泌，箭頭指示分泌的基質(zhì)。插圖示倒置相差顯微鏡觀察7 d時(shí)細(xì)胞-PGA復(fù)合物，細(xì)胞材料黏附緊密，細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多 c:DiO標(biāo)記的細(xì)胞接種至PGA支架材料上7 d的黏附情況 d:激光掃描共聚焦顯微鏡觀察有大量DiO標(biāo)記的平滑肌樣細(xì)胞分布于PGA纖維上，且有豐富的細(xì)胞外基質(zhì)分泌其中，插圖示橫斷面情況 e～f:隨著細(xì)胞-PGA復(fù)合物在反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)，PGA逐漸降解，形成管樣組織

2.6膠原定量和生物力學(xué)檢測(cè)反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)8周構(gòu)建組織的膠原含量達(dá)(48.4±6.65) μg/g濕重，而正常的人大隱靜脈的膠原含量為(78.15±5.57)μg/g濕重，達(dá)到正常血管的60%。將構(gòu)建的組織沿環(huán)狀面切開(kāi)，根據(jù)應(yīng)力—應(yīng)變曲線可以看出：反應(yīng)器內(nèi)力學(xué)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)構(gòu)建組織的最大張力達(dá)0.63×106Pa，達(dá)到了正常人大隱靜脈的65%。8周后，構(gòu)建組織的縫線張力達(dá)(0.93±0.04) N，達(dá)到正常大隱靜脈的56%(表2)。以上結(jié)果說(shuō)明在生物反應(yīng)器內(nèi)力學(xué)刺激的培養(yǎng)下，所構(gòu)建的管樣組織力學(xué)強(qiáng)度達(dá)到了正常大隱靜脈的近60%。

3 討論

隨著自體血管移植技術(shù)的發(fā)展，尤其是人工合成血管(如Dacron、ePTFE等)制備技術(shù)的不斷提升，使臨床修復(fù)直徑大于6 mm血管的成功率大大提高。但是對(duì)于直徑小于6 mm的小口徑血管由于缺乏內(nèi)皮覆蓋,易發(fā)生血栓，造成血管堵塞。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為解決小口徑血管重建的難題提供了可能。但由于種子細(xì)胞來(lái)源不足而造成其很難很快進(jìn)入臨床應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)證明在TGF-β1和BMP4的聯(lián)合誘導(dǎo)作用下，hASCs獲得了平滑肌細(xì)胞的形態(tài)，并且表達(dá)平滑肌細(xì)胞的特異性標(biāo)記物α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC。同時(shí)我們的前期試驗(yàn)還表明誘導(dǎo)后的細(xì)胞接種于膠原凝膠上出現(xiàn)和正常成熟平滑肌細(xì)胞一樣的收縮反應(yīng)。說(shuō)明hASCs可作為種子細(xì)胞用于構(gòu)建組織工程化血管。

A:構(gòu)建組織(a、c、e)和人臍動(dòng)脈(b、d、f)，其中a～b為H&E染色，c～d為Masson三色染色，e～f為Gomori醛復(fù)紅染色。箭頭示彈性纖維，標(biāo)尺長(zhǎng)度：100 μm B:免疫組化檢測(cè)反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)培養(yǎng)8周的組織表達(dá)α-SMA和calponin的情況，標(biāo)尺長(zhǎng)度：50 μm

為了使構(gòu)建的組織獲得理想的力學(xué)強(qiáng)度，必須使接種的材料有合適的降解速率，本實(shí)驗(yàn)使用PGA作為支架材料，因?yàn)樗哂辛己玫纳锵嗳菪裕琋iklason等[8]就是應(yīng)用PGA構(gòu)建了第一個(gè)自體血管移植物并回植體內(nèi)的。同時(shí)，我們也在前期研究中應(yīng)用PGA和成熟平滑肌細(xì)胞成功構(gòu)建了大口徑血管壁組織。但是，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的PGA膜片支架是手工編織的，容易造成PGA纖維的分布不均，從而造成細(xì)胞分布不均，構(gòu)建的組織薄厚不均，影響最終的力學(xué)強(qiáng)度。因此，有待改進(jìn)技術(shù)以提高PGA膜片支架的一致性、均一性。

研究表明循環(huán)張力可以明顯提高構(gòu)建血管組織的力學(xué)強(qiáng)度，降低細(xì)胞的程序性死亡[9]，促進(jìn)細(xì)胞的定向排布，增加膠原含量，防止平滑肌細(xì)胞的表型改變[10]，從而增加平滑肌細(xì)胞的收縮特性。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，在生物反應(yīng)器內(nèi)動(dòng)態(tài)刺激下所構(gòu)建的組織工程化平滑肌層組織學(xué)結(jié)構(gòu)層次清晰，結(jié)構(gòu)致密，膠原含量明顯增加，同時(shí)，在動(dòng)態(tài)力學(xué)的刺激下，新生組織細(xì)胞分布有序，膠原濃密，排列規(guī)則。說(shuō)明適宜的力學(xué)刺激有利于血管組織的形成和細(xì)胞適應(yīng)性再塑。這一觀察結(jié)果與Seliktar的報(bào)道[11]相一致，他們認(rèn)為循環(huán)張力通過(guò)過(guò)度表達(dá)金屬蛋白酶-2以提高基質(zhì)的重塑。同時(shí)我們觀察到，誘導(dǎo)的hASCs在沒(méi)有生長(zhǎng)因子的作用下在生物反應(yīng)器內(nèi)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)8周仍能維持平滑肌細(xì)胞的表型。

表2 構(gòu)建組織的生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果，與人大隱靜脈(HSV)作比較

本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的生物反應(yīng)器，主要模擬了血管承受的雙軸張力，即細(xì)胞橫斷面上的同向張力和軸向張力。而對(duì)于血管承受的流體剪切應(yīng)力，即流動(dòng)的血液順血流方向作用于腔側(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞單位面積上的力，尚無(wú)法模擬。因此，應(yīng)進(jìn)一步完善生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)，使之能模擬立體剪切應(yīng)力作用，以使之能更完全模擬體內(nèi)流體作用的環(huán)境。

血管的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)緩慢而復(fù)雜的過(guò)程，其生物力學(xué)性能也是隨著血管的不斷生長(zhǎng)在血流的不斷作用下而逐漸提高的，體外生物反應(yīng)器只是給予細(xì)胞—生物材料一個(gè)更接近的生長(zhǎng)環(huán)境，其最終的目的是要回植到體內(nèi)，用于血管缺損的修復(fù)。而體內(nèi)的大環(huán)境才是血管生長(zhǎng)成熟的最佳環(huán)境，體內(nèi)的血流刺激才是最有效的作用因素。下一步可考慮接種上內(nèi)皮細(xì)胞，回植體內(nèi)，在血流的作用下，使其進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育。從而構(gòu)建出更符合生理功能的血管組織。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hASCs在TGF-β1和BMP4的作用下可誘導(dǎo)分化為平滑肌細(xì)胞，并且誘導(dǎo)的細(xì)胞可在三維PGA支架上保持平滑肌細(xì)胞的表型。同時(shí)將其接種于PGA支架材料上，可在生物反應(yīng)器內(nèi)形成具有一定強(qiáng)度的小口徑血管組織(內(nèi)徑4 mm)。另外此方法還可以用以構(gòu)建其他小口徑的肌管組織如輸尿管、膽囊管和卵巢管等。

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