圍產期間充質干細胞的分離和規模制備與保存技術及應用

韓之波 （中國醫學科學院血液學研究所血液病醫院實驗血液學國家重點實驗室 天津300020）

圍產期間充質干細胞的分離和規模制備與保存技術及應用

韓之波 （中國醫學科學院血液學研究所血液病醫院實驗血液學國家重點實驗室 天津300020）

間充質干細胞（MSC）是來源于中胚層的、具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞。系統地研究了P-MSC與骨髓MSC生物學特性和功能的異同，建立的圍產期間充質干細胞的分離和規模制備與保存技術體系，為推動我國乃至國際干細胞藥物的開發以及干細胞產業的發展起到積極的作用。

圍產 間充質干細胞 骨髓 生物學

間充質干細胞（MSC）是來源于中胚層的、具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞。MSC能在特定條件下分化為包括神經細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、脂肪細胞在內的多組織系統的細胞。此外，MSC對造血、免疫炎癥反應、血管新生等人體重要功能起重要調節作用。MSC是繼造血干細胞之后又一類已經在世界范圍內廣泛臨床試驗的干細胞，是組織工程的種子細胞。MSC因具有廣闊的臨床應用前景，其技術產品的開發已經成為全球生物醫藥領域的競爭熱點。

截止至2012年2月，在美國國立衛生研究院（National Institutes ofHealth，NIH）注冊的關于間充質干細胞的臨床研究已經超過200項。和其他干細胞相比，間充質干細胞因其具有良好的擴增能力、來源廣泛、可避免倫理學問題等優勢，已逐漸成為干細胞治療的重要組成部分。中國是干細胞治療臨床研究比較發達的國家之一。國內的科研機構或醫院在NIH注冊了48項關于間充質干細胞的臨床研究。目前美、英、法、韓、印等國家藥品監督管理部門已批準了20多個干細胞制品分別進入I、II、III期臨床研究。2010年5月4日美國FDA授權人骨髓間充質干細胞Prochymal作為孤兒藥用于Ⅰ型糖尿病的臨床治療，韓國2011年7月1日批準了自體骨髓間充質干細胞Hearticellgram-AMI上市，用于心梗和心衰治療。2012年1月19日韓國又批準了全球首個的異基因干細胞藥物——臍帶血來源間充質干細胞CartiStem上市，用于植入治療關節軟骨缺損。

然而，從何種組織、用什么技術去分離培養出高純度、安全、有效、穩定、可規?；苽?、質量可控、數量足夠的MSC，這是干細胞領域的核心技術。骨髓是以前公認的MSC主要來源，但實際上骨髓中MSC的含量極少，僅占成人骨髓單個核細胞的0.002%～0.005%。近年發現臍血、臍帶、胎盤、脂肪、肌肉、頭皮、牙周質等多種組織中也可分離得到MSC。研究還發現，人體內MSC的數量隨著年齡的增大而減少，在骨髓細胞中的含量分別是出生時為1/10 000，10歲為1/10萬，30歲為1/25萬，50歲為1/40萬，80歲為1/200萬。由于人體內MSC是供人一生中組織修復和再生所必需的，從倫理學、醫學、細胞工程學的角度來看，成人體內的MSC顯然不適合作為一種可以批量化生產用于常規治療的MSC來源，新的臨床適用型MSC亟待開發。

韓忠朝教授領導的科研團隊近十年來一直致力于臨床適用型間充質干細胞的鑒別、分離和培養擴增，研究發現人臍帶、胎盤羊膜和絨毛膜、臍血和羊水等與出生相關的圍產期組織富含間充質干細胞，現國際上統稱為圍產期間充質干細胞。圍產期間充質干細胞（Perinatal mesenchymal stem cells，P-MSC）是介于胚胎干細胞和成人干細胞之間的干細胞，其增殖和分化能力比胚胎干細胞低，但明顯高于成人干細胞（見圖1）。同時，韓忠朝教授領導的科研團隊系統地研究了P-MSC與骨髓MSC生物學特性和功能的異同，發現P-MSC與骨髓MSC有類似特性，但增殖分化能力更強，免疫原性更低，具有很好的造血支持、免疫調節以及組織修復與再生功能，其機制與P-MSC分泌眾多因子和PGE2等有關。P-MSC不具致瘤性,也無明顯促瘤性,對白血病生長有抑制等作用。由于胎盤臍帶取材方便并富含干細胞，P-MSC的提取和應用系變廢為寶且不存在倫理問題，特別易于規模化制備和產業化操作。

韓忠朝教授領導的科研團隊以圍產期間充質干細胞的分離、培養為主線，結合一些分析干細胞特性和基因穩定性的新技術、種子干細胞庫技術、成品庫技術條件、拉曼光譜散射分析技術、干細胞活性精確分析技術等，形成了完整的P-MSC庫技術流程，包括供者篩選、組織（胎盤、臍帶、臍帶血）采集、P-MSC分離與培養鑒定、種子干細胞檢測保存、終產品規模制備與檢測、保存和發放使用的技術體系。

韓忠朝教授領導的科研團隊組建了世界第一個圍產期間充質干細胞庫，為公眾提供干細胞存儲服務，儲存量已突破10 000份。同時提供高純度P-MSC供研究用。干細胞庫工藝流程包括：①干細胞供者的篩查。②臍帶胎盤的無菌采集、運輸、保存，既能保證P-MSC的生物學活性，又能減少污染。③種子P-MSC庫技術，P-MSC的分離、規模化制備和保存技術是P-MSC庫建立的核心技術。通過對酶的種類、濃度、時間、溫度進行實驗，篩選出最佳組合，顯著提高了細胞的分離效率。通過對凍存保護劑的配方進行優化，顯著提高了細胞的活率。用氣相液氮罐保存細胞，大大降低了細胞間交叉污染的可能。④P-MSC的檢測，由于是新技術，國內外缺乏檢測標準。為了確保干細胞的安全性、有效性和質量可控性，科研團隊又建立了MSC庫質量標準，其中檢測參數二十幾項，藥典上沒有的參數科研團隊都一一建立方法，并完成了工作量巨大的方法驗證工作。此外，在國際上首次建立拉曼散射光譜傳感分析MSC的生物活力技術，測量不同狀態下干細胞的特征拉曼光譜，為干細胞生物活力的分析提供了無創性快速檢測技術。⑤質量管理體系：建立了一套完善的質量管理體系，對人、機、料、法、環等各個環節進行質量管理，實現對供者篩查、組織采集、運輸、加工、檢測鑒定、凍存、放行等全過程的嚴格監控，保證細胞庫的正常運行。通過攻關，研究團隊在國際上首次制定出《臍帶間充質干細胞庫公共庫技術條件》、《臍帶間充質干細胞庫自體儲存技術條件》和《臍帶間充質干細胞制品技術條件》3種技術標準，獲政府頒發的產品執行標準證書，通過ISO 9001國際認證。這些標準規范了干細胞的研究和產品制備，推動了我國干細胞產業標準化進程，制定的企業標準為國家行業標準的制定提供了依據。⑥一類新藥——注射用臍帶間充質干細胞的臨床前安全性的評價，包括對體外連續傳代培養的P-MSC選取不同代次進行傳代穩定性的研究，以觀察傳代過程是否會發生細胞的突變。檢測參數包括：染色體核型、癌基因、端粒酶、細胞表型、分化能力。結果表明，P-MSC經過傳代后不會發生細胞惡性轉化，傳代過程安全穩定。同時，在注射用臍帶間充質干細胞的臨床前安全性評價中開展了全方面的實驗，包括：急性毒性試驗、長期毒性試驗、全身過敏反應、溶血性試驗、致瘤試驗、對腫瘤生長的影響試驗。

另外，韓忠朝教授領導的科研團隊對注射用臍帶間充質干細胞的制備工藝進行了嚴格的規范，對原料、中間品、成品都采取了嚴格的質量控制措施，制定了《注射用間充質干細胞（臍帶）制造和檢定規程》，規定了供者原代傳代細胞庫質量標準、成品質量標準。根據質量標準，篩選出供者細胞作為安全種子的來源，對每批成品進行質量檢驗，全部項目合格方可入庫供臨床使用，以此保證臨床供應細胞的安全性。該質量標準已經過中檢所專家審核，同時按該規程制備的樣品經中檢所復核檢驗全部合格。

采用自主創新技術形成的產品也產生了良好的經濟效益，從2007年起投入市場到2011年12月底，累計收入達1.05億萬元人民幣。同時，該技術體系的建立也受到國內外的廣泛關注。2009年3月3日，韓忠朝應邀在法蘭西國家醫學科學院（Academie Nationale de Medecine）院士會議上報告了圍產期間充質干細胞的臨床前和臨床實驗性治療的成功結果，引起該院的高度重視。會后法蘭西國家醫學科學院專門成立了5個院士工作小組，調查分析圍產期間充質干細胞的科學優勢、潛在風險和倫理法律相關問題，提出干細胞治療的建議，并在法蘭西國家醫學科學院院刊上發表研究報告。隨著研究的深入，法蘭西國家醫學科學院于2011年12月13日再次邀請韓忠朝于2012年1月在該院作一個《自體和異基因圍產期干細胞的應用》的學術報告，獲得院士們的高度評價。

韓忠朝教授領導的科研團隊建立的圍產期間充質干細胞的分離和規模制備與保存技術體系，為推動我國乃至國際干細胞藥物的開發以及干細胞產業的發展起到積極的作用。截至2011年11月22日，美國NIH的臨床試驗網站（www.clinicaltrials.gov）已登記的P-MSC臨床試驗已經達58項（33項臍帶MSC，22項臍血MSC，3項胎盤MSC）。自從2007年韓忠朝教授領導的科研團隊組建了世界第一個圍產期間充質干細胞庫以來，目前國際和國內已經有多家干細胞庫開展了圍產期間充質干細胞的技術服務，還有多個圍產期間充質干細胞相關的細胞治療藥物正在進行臨床前或臨床研究。國內單位在國內外學術刊物發表圍產期間充質干細胞相關的臨床試驗結果論文有31篇，接受實驗性治療的患者近400例，涉及GVHD、自身免疫疾病、再障、心臟病、腦血管病、肝硬化、糖尿病等，結果顯示出其具有良好的應用前景，為許多難治性疾病提供了新的治療方案?！?/p>

2012-03-06