分光光度法測定垃圾堆肥中蛋白質的不確定度評定

張玉林，董曉丹

（上海環境衛生工程設計院，上海 200232）

分光光度法測定垃圾堆肥中蛋白質的不確定度評定

張玉林，董曉丹

（上海環境衛生工程設計院，上海 200232）

根據GB 5009．5—2010中分光光度法對垃圾堆肥中蛋白質的含量進行測定，分析其在測定過程中的不確定度來源，并對測試結果做不確定評定。

分光光度法；垃圾堆肥；蛋白質；不確定度

國家計量技術規范《測量不確定度評定與表示》中指出檢測結果的完整報告應包含測量不確定度，定量說明結果的質量［1］。在《計量學基礎及通用術語的國際詞匯》中測量不確定度定義為一個與測量結果有關的參數，它表征帶測量數值的不確定度信息［2］。由于垃圾的不確定性較大，分析過程較復雜，為得到堆肥中蛋白質的準確含量，確保堆肥產品運用到實踐生產中的有效性，必須對分析結果進行不確定度的評價，確定置信區間，以保證所測數據的可信度。

1 測定方法

依據GB 5009．5—2010中分光光度法，取適量均勻固體試樣0．5 g左右（精確到0．001 g），移入100 mL定氮瓶中，加入0．1 g硫酸銅、1 g硫酸鉀及5 mL硫酸。輕搖后于瓶口放1個小漏斗。將定氮瓶放在電爐上小心加熱至瓶中液體呈藍綠色并澄清透明后取下冷卻，然后小心移入100 mL容量瓶中定容。同時做試劑空白實驗。

用0．100 0 g/L氨氮標液作為使用液建立標準曲線，分別吸取 0．00、0．05、0．10、0．20、0．40、0．60、0．80、1．00 mL 置于 10 mL 比色管中，加入4．0 mL乙酸鈉乙酸緩沖溶液及4．0 mL顯色劑，加水稀釋至刻度，混勻。置于100℃水浴鍋中加熱15 min。取出冷卻至室溫。以零管為參比，1 cm比色皿，于400 nm波長處測量吸光度，繪制標準曲線。

試樣測定：精密吸取2 mL試樣溶液和同等空白溶液，分別于10 mL比色管中，按標準曲線顯色過程操作，測得吸光度并與標準曲線比較定量或代入標準回歸方程求出含量。

2 數學模型建立

以下為試樣中蛋白質的含量計算公式，即為該測試方法的數學模型。

式中：X為試樣中蛋白質的含量（g/100 g）；c為試樣測定液中氮的含量（μg）；c0為試劑空白測定液中氮的含量（μg）；V1為試樣消化液定容體積（mL），100 mL；V2為制備試樣溶液的消化液體積（mL），5 mL硫酸；V3為試樣溶液總體積（mL），10 mL；V4為測定用吸取試樣溶液體積（mL）；m為試樣質量（g）；F為氮換算為蛋白質的系數，一般取值為6．25。

3 不確定度來源分析

試樣中蛋白質含量的不確定度來源主要有：標準物質引入的不確定度U（c標）、氨氮標準曲線建立引入的不確定度U（c曲）、曲線擬合和引用的不確定度U（cm）、未知樣品稱量引起的不確定度U（m）、未知樣品濃度c測試過程產生的不確定度U（c未）、重復性測試產生的不確定度U（A）、數據修約引入的不確定度U（c修）。

4 不確定度計算

4.1 標準物質引入的不確定度U（c標）

采用國家環保總局的標樣1．000 g/L，不確定度區間半寬為0．3%，屬于正態分布，95%置信概率下，其相對標準不確定度為：

4.2 氨氮標準曲線建立引入的不確定度U（c曲）

4.2.1 氨氮標準使用液的配置引入的不確定度U（V稀）

氨氮標準儲備液1．000 g/L，氨氮標準使用液0．1 g/L，使用A級10．00 mL單標線移液管，A級100 mL容量瓶量取液體體積時引入的不確定度采用B類方法評定。從JJG 196—2006常規玻璃量器檢定規程中查出，A級10．00 mL單標線移液管的誤差為±0．02 mL，A級100 mL容量瓶誤差為±0．10 mL，A級1 mL流出式分度吸量管誤差為±0．008 mL。不同體積的玻璃儀器引入的不確定度見表1。

計算出A級10．00 mL單標線移液管、A級100 mL容量瓶、A級1 mL流出式分度吸量管不確定度合成，得到標準曲線建立過程儀器相對不確定度：

4.2.2 10 mL比色管引入的不確定度U（V10比）

樣品移入比色管中定容，所用的比色管為10 mL±0．025 mL比色管，按均勻分布，取K=，則示值允許誤差引入的不確定度為：U（V1）0=0．025/=0．014 4 （mL）。

標準溶液配制時的室溫為（20±2）℃，水的體積膨脹系數為2．1×10-4℃-1，由溫度變化導致的定容體積變化，按均勻分布，取K=，得出溫度變化導致定容體積變化引入的不確定度為：U（V）t=2×10×2．1×10-4/=0．002 4 （mL）。

合成以上2個分量得到標準溶液系列最高濃度點定容過程引入的不確定度和相對不確定度分別

合成以上2個分量得到標準溶液系列平均濃度點定容過程引入的相對不確定度為：

4.3 曲線擬合和引用的不確定度U（cm）

工作曲線共有7個不同濃度點并測定1個空白點，氨氮每個質量濃度點讀數2次，加入量和吸光度分別見表2。

表2 工作校準曲線上各標準點的濃度及吸光度

空白測定值0．054 0。校準吸光度為0．000 0、0．035 0、0．073 7、0．135 5、0．270 4、0．409 1、0．546 5、0．681 8。設定數學模型計算出的校準曲線回歸方程斜率為0．006 8，回歸方程的截距為 0．001 1，回歸系數 0．999 9。

y=bx+a=0．006 8x+0．001 1。

依據貝塞爾公式對工作曲線繪制過程產生的不確定度進行計算，其中實驗標準差：

標準曲線的標準不確定度（曲線上每個濃度測量2次共7個點，n=2×7=14，待測樣品測量次數p=2，未知樣品校準吸光度為0．291 4、0．291 8，平均值為0．291 6，未知樣品測出吸光度后回歸算出濃度為cm=42．72 μg，工作曲線標樣含量平均值為 45．00 μg。

表1 玻璃儀器引入的不確定度

式中：S為校準曲線的標準差；P為樣品溶液的測定次數，p=2；n為校準溶液（含空白溶液）的測定總次數，n=14；b為校準曲線的斜率，其值為0．006 8；a為校準曲線的截距，其值為0．001 1；m為由校準曲線方程求得的樣品溶液中蛋白質含量，μg；為不同校準標準溶液中蛋白質濃度的平均值，μg；xi為不同校準標準溶液的濃度點的配置值，μg；xj為針對每一次不同標準溶液實測的吸收值由校準曲線方程計算出的蛋白質濃度的測定值，μg；yi為單次標準溶液吸光度的測定值。

則工作曲線變動的質量濃度c的相對不確定度為：

4.4 未知樣品稱量引起的不確定度U（m）

4.4.1 天平分辨力引入的不確定度U（1m）

根據證書可知所用天平的分辨力為0．000 1 g，屬于均勻分布，則U（1m）=0．29×0．000 1=0．000 029 （g）。

4.4.2 稱量的變動性引入的不確定度U（2m）

樣品質量為m=0．523 3 g，準確至最大允差±0．000 2 g，K=，均勻分布，相對不確定度為：U（2m）=0．000 2=0．000 115 （g）。

4.5 未知樣品濃度測試過程產生的不確定度U（c未）

4.5.1 消解液定容所用容量瓶的不確定度U（V1）

4.5.2 制備試樣溶液的消化液體積U（V2）

5 mL單標線移液管引入的不確定度來源有2個方面：①體積定值的準確性引入的不確定度，按制造商給定的容量允差為±0．015 mL，按均勻分布換算成標準不確定度為0．015/＝0．008 7（mL），==0．001 7；②由于校正和

使用時的溫度不同所引起的體積不確定度，可視為相差2℃，水的膨脹系數為2．1×10-4℃-1，轉換成標準不確定度為：

4.5.3 試樣溶液總體積引入的不確定度U（V3）

樣品移入10 mL比色管中定容，所用的比色管為（10±0．025）mL比色管，按均勻分布，取K=，則示值允許誤差引入的不確定度為：U（V10）=0．025/=0．014 4 （mL）。

標準溶液配制時的室溫為（20±2） ℃，水的體積膨脹系數為2．1×10-4℃-1，由溫度變化導致的定容體積變化，按均勻分布，取K=，得出溫度變化導致定容體積變化引入的不確定度為：U（V）t=2×10×2．1×10-4/=0．002 4（mL）。

4.5.4 移取消化液體積不確定度U（V4）

取樣使用A級2．00 mL單標線吸量管，引入不確定度中只考慮移液管體積和實際操作溫度變化2℃帶來的不確定度。因為A級2．00 mL單標線移液管充滿液體至滿刻度的變動性，包含在樣品重復性測試中，故不需要考慮。取樣過程合成相對不確定度為：

4.5.5 樣品消解過程中產生的測量不確定度U（V消）

合成以上幾個分量得到標準溶液系列平均濃度點定容過程引入的相對不確定度為：

4.6 重復性測試產生的不確定度U（A）

按工作曲線相同操作步驟，分別吸取2 mL消解液與10．0 mL比色管中，對垃圾堆肥進行6次重復性測量分析，數據見表2。

表2 樣品重復性測量數據

測量時所用數據為樣品平行測定與重復性測量的數據，因此不需要評定每次進行儀器讀數變化引起的不確定度［3］。由表2數據進行排序，樣品濃度最高 45．79 μg，最低 42．72 μg，可以用 A類不確定度評定的極差法進行不確定度計算，查c與n的對應關系得：

日常檢測試樣1次數據，根據表2中序號1的數據，標準曲線和公式測得水樣濃度值為42．72 μg。樣品重復性測試產生的相對不確定度為：

4.7 數據修約引入的不確定度U（c修）

根據標準給出的有效位數，修約間隔為修約值的最小單元0．01%，數據修約的標準不確定度

樣品濃度為6．31 g/100g，其相對不確定度為：

5 合成標準不確定度U（Cc）及擴展不確定度U

由公式（1） ～（7） 合并各組相對不確定度可得：

未知樣品濃度X=6．31 g/100 g，則合成標準不確定度為：

取包含因子k=2置信概率近95%，計算擴展不確定度U=kU（Cc）=2×0．976 8（g/100 g）=1．95（g/100 g）。

6 結論

1）用比色法測定堆肥中蛋白質含量，取包含因子k=2時，根據標準蛋白質大于等于1 g/100 g時，結果保留3位小數，所以最后結果表示為（6．31±1．95） g/100 g。

2）通過計算過程，比較各不確定度分量的權重，可知本方法影響不確定度的因素中，工作曲線擬合、未知樣品濃度測試過程產生的不確定度和樣品重復性測量及標準樣品引入的不確定度為主要不確定度分量。

3）為了降低不確定度，可以通過提高操作人員的業務水平，適當增加樣品重復測試次數，多次繪制工作曲線等方法，提高檢測結果的準確性。

［1］JJF 1059—1999 測量不確定度評定與表示［S］．北京：中國計量出版社，1999．

［2］張淑芹．測量不確定度的評定方法［J］．品牌與標準化，2010（4）：40-41．

［3］楊振宇．元素相對測定不確定度的評定［J］．理化檢驗，2005（5）：36-40．

Uncertainty of Proteins Test in Waste Composting by Spectrophotometry

Zhang Yulin，Dong Xiaodan
（Shanghai Environmental Sanitary Engineering Design Institute,Shanghai 200232）

According to the provisions of spectrophotometry in GB/T 5009．5—2010,the content of protein in waste composting was tested．In the determination process,the sources of its uncertainty were analyzed,and the uncertainty of the results was evaluated．

spectrophotometry；waste composting；protein；uncertainty

X833

A

1005-8206（2012）05-0049-04

2012-05-21

張玉林（1982—），主要從事環境監測、化學分析、實驗室質量控制工作。

（責任編輯：鄭雯）