葡萄籽原花青素提取物對糖尿病小鼠血糖的影響

王 穎，張桂芳，徐炳政，姚 笛，張東杰*

1黑龍江八一農墾大學食品學院;2黑龍江省農產品加工工程技術研究中心，大慶，163319

糖尿病是由遺傳因素、免疫功能失調、自由基毒素等多種致病因子作用于機體導致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發的糖、蛋白質、脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂綜合癥。近年來，糖尿病發病率急速上升，據世界衛生組織統計，糖尿病已成為繼惡性腫瘤和心腦血管疾病之后的第三大嚴重威脅人類健康的慢性非傳染性疾病［1］。目前對于糖尿病的根治尚無有效方法，臨床上常用于糖尿病治療的西藥雖然對血糖有較好的控制作用，但毒副作用較大。因此，尋找安全、廉價、有效降糖的天然產物及成分對于糖尿病治療具有重要意義。葡萄籽原花青素提取物是從葡萄籽中分離出的多酚類混合物，現代研究表明，GSPE具有極強的抗氧化活性［2，3］，并且具有調節血脂［4］和預防心血管疾病［5，6］等作用。目前，抗氧化活性成為GSPE研究的熱點，但其降糖作用及作用機制卻鮮有報道，本實驗旨在研究GSPE的降血糖作用及其作用機制，為新型降糖藥物和功能性食品的深入開發提供藥理學依據。

1 材料與方法

1.1 動物材料

昆明種小鼠，雄性，體重(20～25)g，購自長春生物制品廠，小鼠飼料為標準鼠飼料。

1.2 實驗材料及試劑

葡萄籽原花青素提取物(GSPE，純度＞95%，購自天津尖蜂天然產物有限公司，實驗前用蒸餾水溶解，配制成所需濃度);格列本脲(國藥準字H11020883，北京太洋藥業有限公司);四氧嘧啶(ALX，上海億欣生物科技有限公司);怡成血糖測試儀及測定試紙(北京怡成生物電子技術有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒與丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所);碘［125I］胰島素放射免疫分析藥盒(上海瑞齊生物科技有限公司);KDC-40低速離心機(科大創新股份有限公司);氯化鈉(國產分析純)等。

1.3 糖尿病模型的建立方法

健康小鼠50只，適應性喂養一周，稱重。隨機選取10只作為正常對照組，其余分為四個模型組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，每組10只。模型組小鼠禁食不禁水12 h后，腹腔注射ALX生理鹽水溶液(濃度2%，新鮮配制)，其余四組分別按80、70、60和50 mg/kg四個劑量連續腹腔注射4 d。模型建立期間，采用小鼠尾部靜脈取血法，每天測定給藥8 h后的小鼠空腹血糖值，觀察小鼠血糖變化。按文獻方法［7，8］，選用血糖值≥14.5 mmol/L的小鼠作為糖尿病成功模型。

1.4 實驗動物分組與飼養

取健康小鼠70只，隨機抽取10只為正常對照組(BD)，其余按ALX誘導糖尿病最佳作用濃度腹腔注射，建立糖尿病模型。將成功造模糖尿病小鼠隨機分為5組，每組10只，分別標記為模型對照組(MoD)、格列本脲處理組(GD)、GSPE低劑量組(LD)、GSPE中劑量組(MD)和 GSPE高劑量組(HD)。

每組小鼠(10只)飼養在塑料飼養籠中，飼養籠底部墊有碎紙屑，頂部為鋼絲網蓋，配有自動飲水器，室溫(20±1)℃，相對濕度50%±5%，喂食標準飼料，自由飲水。

1.5 給藥劑量和方法

每天同一時間灌胃給藥1次，連續給藥21 d。具體藥物劑量見表1。

表1 實驗動物的藥劑分配Table 1 Reagent distribution of experimental animals

1.6 血糖值及體重測定方法

實驗期間每天觀察小鼠體態特征變化，記錄死亡率;分別于給藥0、7、14和21 d的同一時間，測定空腹血糖值及體重。

1.7 口服糖耐量試驗

糖尿病模型小鼠各組于末次給藥后禁食8 h，口服葡萄糖2.5 g/kg，分別于0、0.5、1.0、2.0 h進行尾部靜脈取血，測定血糖值。

1.8 血清指標檢測

小鼠灌胃實驗結束后，摘取眼球，取血，離心，取血清，按照試劑盒方法測定血清中胰島素含量、MDA含量和SOD活性［9］。

1.9 數據統計學分析

2 結果

2.1 糖尿病小鼠模型的建立

如圖1、圖2所示，與正常對照組比較，腹腔注射四氧嘧啶能明顯提高小鼠血糖值，且具有穩定性。在注射的第1、2 d高劑量注射組的死亡率低于低劑量注射的死亡率，而第3、4 d，高劑量注射組的死亡率明顯上升。由此可知，四氧嘧啶注射第2 d適合藥物篩選，選擇第1 d 80 mg/kg ALX溶液，第二天追加80 mg/kg ALX溶液，糖尿病小鼠模型成功率最高，死亡率＜10%。

圖1 不同濃度ALX處理后小鼠血糖濃度變化Fig.1 Blood glucose change of mice treated by ALX in different concentrations

圖2 不同濃度ALX處理小鼠后的死亡率Fig.2 Mortality rate of mice treated by ALX in different concentrations

2.2 一般情況

小鼠造模成功后，明顯出現多飲、多食、多尿癥狀，小鼠活動率降低，精神萎靡，皮毛粗糙。灌喂給藥后，格列本脲處理組、GSPE試驗組小鼠糖尿病癥狀緩解，精神狀態良好。

2.3 GSPE對ALX糖尿病小鼠體重的影響

圖3為GSPE對ALX糖尿病小鼠體重的影響。小鼠造模成功后，分別記錄0、7、14、21 d體重。給藥0～7 d，糖尿病小鼠體重下降明顯。連續21 d給藥，GSPE各劑量組小鼠體重均有所上升，GSPE高劑量組對糖尿病小鼠體重影響與格列苯脲作用效果相似，體重增加明顯(P＜0.05)。表明GSPE能夠有效緩解糖尿病小鼠消瘦癥狀，對糖尿病小鼠體重下降具有一定的治療與恢復作用。

圖3 GSPE對ALX糖尿病小鼠體重的影響Fig.3 Effect of GSPE on the body weights of ALX diabetic mice

2.4 GSPE對ALX糖尿病小鼠空腹血糖的影響

圖4為GSPE對ALX糖尿病小鼠空腹血糖的影響。由圖可以看出，與正常對照組比較，腹腔注射ALX后，所有糖尿病小鼠空腹血糖值均明顯升高，且具有顯著性，表明糖尿病小鼠模型造模成功。小鼠灌胃給藥21 d后，模型對照組血糖仍處于較高水平。與模型對照組比較，格列本脲處理組小鼠血糖顯著降低(P＜0.01)，GSPE中、高劑量組血糖顯著降低(分別為P＜0.05，P＜0.01)。結果提示，GSPE可以降低ALX誘導糖尿病小鼠血糖，降糖效果與藥物劑量成正相關。

圖4 GSPE對ALX糖尿病小鼠空腹血糖的影響Fig.4 Effect of GSPE on fasting blood glucose of ALX diabetic mice

2.5 GSPE對ALX糖尿病小鼠葡萄糖耐受量的影響

圖5為GSPE對ALX糖尿病小鼠葡萄糖耐受量的影響。由圖可以看出，給予葡萄糖0.5 h后，各組小鼠血糖值升至最大值后逐漸下降。與模型對照組比較，0.5 h時，GSPE低、中、高劑量組均可抑制四氧嘧啶高糖小鼠葡萄糖負荷后血糖的升高;與模型對照組比較，2 h后，GSPE中、高劑量組血糖下降顯著(分別為P＜0.05，P＜0.01)。表明GSPE有提高糖尿病小鼠對葡萄糖的耐受能力作用，且高劑量作用效果較好。

圖5 GSPE對ALX糖尿病小鼠葡萄糖耐受量的影響Fig.5 Effect of GEPE on glucose tolerance of ALX diabetic mice

2.6 GSPE對ALX糖尿病小鼠胰島素水平的影響

圖6為GSPE對ALX糖尿病小鼠胰島素水平的影響。與正常對照組比較，模型對照組小鼠胰島素含量下降顯著(P＜0.01);與模型對照組比，GSPE低、中劑量組胰島素水平上升明顯(P＜0.05);格列本脲處理組和GSPE高劑量組胰島素水平上升顯著(P＜0.01)。結果提示，GSPE降低糖尿病小鼠的血糖值與其能夠提高胰島素水平有關。

2.7 GSPE對ALX糖尿病小鼠血清MDA含量和SOD活性的影響

圖8 GSPE對ALX糖尿病小鼠血清SOD活性的影響Fig.8 Effect of GSPE on serum SOD activity of ALX diabetic mice

圖7和圖8分別為GSPE對ALX糖尿病小鼠血清MDA含量和血清SOD活性的影響。血清MDA含量與SOD活性是評價機體抗氧化能力的重要指標。由圖可以看出，與正常對照組比較，模型對照組小鼠血清MDA含量顯著升高(P＜0.01)，SOD活性顯著降低(P＜0.01)，表明模型組小鼠機體抗氧化能力明顯低于正常對照組小鼠，提示四氧嘧啶注射對小鼠抗氧化能力具有減弱作用。但經灌胃給藥GSPE以及腹腔注射格列苯脲后，ALX糖尿病小鼠血清MDA含量和SOD活性有不同程度的改善。與模型對照組小鼠比較，GSPE中、高劑量組糖尿病小鼠的血清MDA含量明顯下降(P＜0.05)，血清SOD活性明顯提高(中劑量組P＜0.05，高劑量組P＜0.01);結果提示，GSPE具有恢復糖尿病小鼠抗氧化能力的效果，中、高劑量組作用效果較好。

3 討論

四氧嘧啶是一種特異性的β-細胞毒劑，其在體內可被胰島β-細胞有效吸收，在細胞內產生過量自由基，改變β-細胞的結構，導致胰島β-細胞的損傷和壞死，胰島素水平降低而出現高血糖等糖尿病癥狀［10，11］，同時糖尿病引起的高血糖可使體內脂質代謝紊亂，引起氧化應激升高，破壞機體的抗氧化能力，引起β-細胞損傷持續惡化［12］，這種作用機制與臨床上Ⅱ型糖尿病相似［13］。四氧嘧啶能夠有效引起血糖升高，且讓其長時間處于較高水平。因此，本實驗采用ALX為誘導劑構建糖尿病模型，在此模型上研究GSPE對糖尿病小鼠的影響。

本實驗在ALX誘導小鼠糖尿病摸索過程中，與正常小鼠比較，四個模型組血糖均顯著上升，小鼠精神萎靡，體重下降，出現“三多”典型糖尿病特征，說明四氧嘧啶誘導糖尿病小鼠成功，但是誘導后期，小鼠出現大量死亡，可能是由于四氧嘧啶導致小鼠β-細胞嚴重受損，體內糖代謝與脂質代謝嚴重紊亂［4］。檢查死亡小鼠，部分出現腹部腫脹，可能是由于胰島及臟器受損充水腫脹破裂。由此，本實驗誘導小鼠模型采用追加藥物法，第一天注射四氧嘧啶溶液為80 mg/kg，第二天注射四氧嘧啶溶液為80 mg/kg，采用本方法，小鼠造模成功率高，死亡率較低。

本實驗發現，ALX引起小鼠體重下降，空腹血糖值上升，血清MDA含量升高，SOD活性降低，血清胰島素水平下降等，與文獻報道相似［14，15］。實驗結果顯示，GSPE能夠降低糖尿病小鼠的空腹血糖、提高糖耐量，增加體重，提升機體胰島素水平，試驗期間小鼠皮毛出現光澤，飲食、飲水量趨于正常，活動量增加，提示GSPE降糖作用機制可能與修復受損胰島β-細胞，提升胰島素水平有關。SOD是機體清除氧自由基的重要酶類，高血糖可使SOD活性下降，減弱其對自由基的清除。機體大量自由基是導致糖尿病并發癥的主要因素。GSPE可以改善糖尿病小鼠SOD活性，降低MDA含量，表明GSPE可以通過提高機體抗氧化能力，清除體內自由基來預防和治療糖尿病及其并發癥。

1 Cockram C.Type 2 Diabetes Practical Targets and Treatments.Asian-pacific type 2 diabetes policy group，2005.1-6.

2 Wu YJ(吳英俊)，Liang YF(梁憶非)，Dong JN(董嘉楠).Advances in research of grape seed proanthocyanidin.J Trop Med(熱帶醫學雜志)，2010，10:1025-1028.

3 Zhu ZQ(朱振勤)，Zhai WY(翟萬銀)，Chen JW(陳季武)，et al.Studies on the antioxidation effects of grape seed procyanidins extract.J East China Normal Univ(Nat Sci) (華東師范大學學報，自科版)，2005，(1):98-102.

4 Yan SF(閆少芳)，Li Y(李勇)，Wu J(吳娟)，et al.Study of the effect of grape seed extract procyanidin on blood lipid regulation and mechanism.Chin J Food Hyg(中國食品衛生雜志)，2003，15:302-304.

5 Xue YW(薛燕濰)，Wang F(王峰).Anti-atherosclerosis of procyanidin on experimental rat and its mechanisms.Chin Prac Med(中國實用醫藥)，2010，13:44-45.

6 Bi L(畢玲)，Fu BP(傅柏平).Advances in research of grape seed proanthocyanidin extracts.Chin New Drugs J(中國新藥雜志)，2008，17:1478-1481.

7 Chen HY(陳紅艷)，Yang XB(楊新波).Diabetic model induced by alloxan in mice and its affecting factors.Bull Acad Mil Med Sci(軍事醫學科學院院刊)，2005，29:535-542.

8 Xiao XH(肖小華)，Xu LY(徐麗瑛)，Zhu LY(朱令元)，et al.Study on the model of diabetic mice and rat induced by alloxan.Sci Mosaic(科技廣場)，2010，10:112-114.

9 Li JZ(李記爭)，Yang G(楊光).Studies of the hypoglycemic effect of Sonchus oleraceus extract on experimental diabetic mice.Lishizhen Med Mater Med Res(時珍國醫國藥)，2011，22:419-421.

10 Wang LP(王柳萍)，Yang B(楊斌)，Zhou L(周麗).Studies on the factors affecting the diabetic model induced by alloxan in mice.J Guangxi Med Univ(廣西醫科大學學報)，2004，21:33-35.

11 Sharma B，Viswanath G，Salunke R，et al.Effects of flavonoid-rich extract from seeds of Eugenia jambolana(L)on carbohydrate and lipid metabolism in diabetic mice.Food Chem，2008，110:697-705.

12 Wang XL(王曉凌)，Jiang LL(姜玲玲)，Ma J(馬靜)，et al.Changes of very long-chain free fatty acids in serum and liver tissues of rats with diabetes induced by high fat food.Chin Gen Pract(中國全科醫學)，2008，11:306-308.

13 Liu D(劉丹)，Lan QQ(藍青強)，Ren M(任明)，et al.Insulin resistance syndrome and treatment research of type 2 diabetes mellitus for machine.The 1st Academic Congress Specialty Committee of Geriatric Medicine，The World Federation of Chinese Medicine Societies(世界中醫藥學會聯合會老年醫學專業委員會成立大會暨第一屆學術會議)，2008.407-410.

14 Shi LX(施利仙)，ShangGuan XC(上官新晨)，Wang WJ (王文君)，et al.Effects of polysaccharide of Cyclocarya paliurus on alloxan-induced diabetic mice.Acta Nutr Sin(營養學報)，2009，3:263-266.

15 Yin SL(殷松樓)，Zhou DM(周冬梅)，Liu CM(劉春梅)，et al.The effects of pioglitazone on oxidative stress of the hearts of diabetic rats.Shandong Med J(山東醫藥)，2010，37:21-22.