miR－18a 對人主動脈內皮細胞血管生成能力的影響

莫 倩， 李 丹， 凌文華

(中山大學公共衛生學院營養系，廣東 廣州510080)

血管生成(angiogenesis)是指血管內皮細胞經過遷移、增殖、管腔形成與基質重塑等產生新生毛細血管網的過程［1］。修復性血管生成主要發生在傷口的愈合與缺血性損傷，而病理性血管生成有助于腫瘤的生長和轉移，并與關節炎、糖尿病視網膜病變等有關［2］。

MicroRNA 是一類由19 ～25 個核苷酸組成的非編碼小分子RNA，通過轉錄后調控參與了人類多種疾病的發生發展過程。miR－17 ～92 家族屬于多順反子家族，其中包括miR－17、miR－18a、miR－19a、miR－20a、miR－19b－1 和miR－92a。目前的研究多集中于促進腫瘤細胞增殖、抗凋亡以及促進腫瘤組織血管生成等方面［3］，對miR－17、miR－20 和miR－92a 的報道較多，而關于miR－18a 的報道較少，特別是其對正常動脈內皮細胞血管生成功能的調節作用尚未見報道。故本研究采用體外人主動脈內皮細胞(human aortic endothelial cells，HAECs)血管生成模型，探討miR－18a 不同表達水平對血管生成功能的調節作用，從而為miR－18a 作為血管性疾病的基因治療靶點提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 材料

內皮細胞培養基購自Sciencell;0.25%胰酶、人纖維黏連蛋白和人血清白蛋白購自Sigma－Aldrich;Matrigel 購自Becton Dickinson;miR－18a mimics 和inhibitor 由GenePharma 合成;LipofectamineTM2000 和Trizol 購自Invitrogen;mirVanaTMqRT－PCR miRNA Detection Kit 購自Applied Biosystems。

2 方法

2.1 細胞培養 HAECs 購自Sciencell，細胞Ⅷ因子相關抗原染色陽性。細胞在內皮細胞培養基(endothelial cell medium，ECM)添加5%胎牛血清、1%內皮細胞生長因子和青霉素(1 × 105U/L)/鏈霉素(100 mg/L)及5% CO2、37 ℃條件下常規培養。

2.2 轉染 細胞傳代至第3 代時，胰酶消化后取3×105個細胞至6 孔板培養12 h。利用LipofectamineTM2000 分別將10 nmol/L miR－18a mimics 和20 nmol/L miR－18a inhibitor 轉染至細胞，轉染物序列見表1。

表1 轉染物序列Table 1. The sequences of transfection complexes

2.3 總RNA 提取 miR－18a mimics 或inhibitor轉染48 h 后，棄去培養基，PBS 清洗2 次后加入1 mL Trizol，反復吹打后室溫放置5 min。加入200 μL 氯仿，劇烈振蕩15 s 后室溫放置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取上層水相約500 μL 于1.5 mL EP 管，加入500 μL 異丙醇，充分混勻，室溫放置10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。棄上清液，加入1 mL 預冷的75%乙醇，渦旋混勻，4 ℃、7 500 r/min離心5 min。棄上清液，室溫晾干5 min，加入0.1%焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)處理的雙蒸水適量溶解RNA，－80 ℃保存備用。

2.4 qRT－PCR 檢測 miR－18a mimics 或inhibitor 轉染48 h 后Trizol 提取總RNA，TaqMan qRT－PCR 檢測miR－18a 表達。每個樣本取1 ng RNA 反轉錄為cDNA，設定反應條件:16 ℃30 min，42 ℃30 min，85 ℃5 min。PCR 按照試劑盒操作指南進行，反應條件:95 ℃10 min，40 個循環:95 ℃15 s，60 ℃1 min。U6 為內參照基因。miR－18a 引物序列:5＇－UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG－3＇。U6 引物序列:5＇－GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCATATTTT－3＇。

2.5 Transwell 小室遷移實驗 Transwell 小室用2.5 mg/L 人纖維黏連蛋白預包被45 min。24 孔板中加入800 μL ECM 培養基并將Transwell 小室放入孔中。miR－18a mimics 或inhibitor 轉染48 h 后胰酶消化細胞，無血清ECM 培養基重懸后將5 ×104個細胞接種至預包被的Transwell 小室。37 ℃培養6 h 后4%多聚甲醛固定，蘇木素染色后倒置顯微鏡計數遷移至微孔膜下層的細胞數目。每個樣本隨機計數5 個視野。

2.6 體外黏附力實驗 96 孔板用2.5 mg/L 人纖維黏連蛋白預包被2 h 后1%人血清白蛋白封閉1 h。miR－18a mimics 或inhibitor 轉染48 h 后胰酶消化細胞，無血清ECM 培養基重懸細胞，接種2 ×104個細胞至預包被的96 孔板中，每組平行5 個樣本。37 ℃培養1 h 后4%多聚甲醛固定，0.5%結晶紫染色后每孔加入100 μL 1%醋酸乙醇振蕩10 min，570 nm 處測定吸光度值。

2.7 毛細血管管腔樣結構形成實驗 96 孔板每孔加入50 μL Matrigel，37 ℃包被30 min。miR－18a mimics 或inhibitor 轉染48 h 后胰酶消化細胞，ECM培養基重懸細胞，接種細胞(每孔5 ×104個)至預包被的96 孔培養板中。37 ℃培養24 h 后4%多聚甲醛固定，0.5%結晶紫染色。隨機選取5 個視野，倒置顯微鏡計數由內皮細胞圍成完整的毛細血管管腔樣結構的數量。

3 統計學處理

應用SPSS 17.0 統計軟件進行分析，數據以均數±標準差(±s)表示，兩組均數比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 內皮細胞miR－18a 的表達

與對照組相比，miR－18a mimics 轉染組miR－18a 表達量增加608 倍，見圖1A;miR－18a inhibitor轉染組miR－18a 表達量下降69%，見圖1B，差異均有統計學意義(P ＜0.05)。

2 體外內皮細胞血管生成功能檢測

2.1 Transwell 小室遷移實驗 miR－18a mimics 轉染組內皮細胞遷移能力與mimics NC 組相比降低60%(P ＜0.01)，見圖2A。miR－18a inhibitor 轉染組遷移能力是對照組的2 倍，見圖2B，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

Figure 1. The expression level of miR－18a in human aortic endothelial cells after transfected with miR－18a mimics (A)or inhibitor(B). ±s.n=3. * P ＜0.05 vs negative control (mimics NC or inhibitor NC).圖1 轉染miR－18a mimics 或inhibitor 后HAECs miR－18a 的表達水平

Figure 2. The migration capacity of human aortic endothelial cells after transfected with miR－18a mimics (A)or inhibitor (B)(hematoxylin staining，×200). ±s.n=5. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs negative control (mimics NC or inhibitor NC).圖2 轉染miR－18a mimics 或inhibitor 后HAECs 的遷移能力

2.2 體外黏附力實驗 與對照組相比，miR－18a mimics 轉染組黏附能力無明顯變化，見圖3A;miR－18a inhibitor 轉染組黏附能力增加43%，見圖3B，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

Figure 3. The adhesion capacity of human aortic endothelial cells after transfected with miR－18a mimics (A)or inhibitor (B). ±s.n=5. * P ＜0.05 vs inhibitor NC.圖3 轉染miR－18a mimics 或inhibitor 后HAECs 的黏附能力

2.3 體外毛細血管管腔樣結構形成實驗 轉染miR－18a mimics 組管腔樣結構數量比對照組減少52%，見圖4A、C;miR－18a inhibitor 轉染組管腔數量與對照組相比增加84%，見圖4B、D，差異顯著(P＜0.01)。

Figure 4. The capillary－like tube formation ability of human aortic endothelial cells after transfected with miR－18a mimics (A)or inhibitor (B)(crystal violet staining，×100). ±s.n=5. ＊＊P ＜0.01 vs negative control (mimics NC or inhibitor NC).圖4 轉染miR－18a mimics 或inhibitor 后HAECs 的毛細血管樣結構形成能力

討 論

本研究通過轉染miR－17 ～92 家族中miR－18a 的mimics 和inhibitor 至人主動脈內皮細胞，觀察miR－18a 對內皮細胞血管生成的影響。結果顯示，miR－18a mimics 轉染后可抑制內皮細胞遷移和管腔形成能力;而miR－18a inhibitor 則對內皮細胞血管形成有促進作用，尤其是對管腔形成能力作用明顯。以上研究結果表明，對于主動脈內皮細胞而言，miR－18a過表達具有抑制血管生成的作用。目前關于miR－18a 對血管生成功能的研究報道較少，但Bonauer 等［4］關于miR－18a 同家族成員miR－92a 的研究結果支持我們的研究，他們在體內、體外實驗中證實人內皮細胞中miR－92a 過表達可抑制血管生成，而在鼠肢端缺血模型和心梗模型中采用antagomir 抑制miR－92a 表達則可增加血管生成，促進受損組織的功能恢復。此外，Doebele 等［5］最新發表的數據亦顯示，miR－17、－18a 及－20a 顯著抑制體外三維細胞球狀體萌芽模型的血管生成。

miR－18a 對動脈內皮細胞血管生成的作用機制目前尚不清楚，通過microRNA 靶基因預測軟件篩選及相關文獻的檢索，我們認為在血管生成過稱中參與細胞基質降解、內皮細胞增殖、遷移、管腔形成的多個細胞因子或者酶類都可能是包括miR－18a 在內的miR－17 ～92 家族潛在的直接分子靶或者靶信號通路下游的效應分子。如TGF－β/Smad 信號通路的上游受體及下游轉錄因子已被證實為miR－18a等miR－17 ～92 家族成員的分子靶［6－7］。此外，VEGF［8］、HIF－1A［9］、JAK1［5］、integrins［4］等這些促血管生成的關鍵分子也被證實是miR－18a 等miR－17 ～92 家族成員的直接靶分子。并且，miR－18a等miR－17 ～92 家族成員還廣泛參與細胞周期、增殖和凋亡的調控［3］。究竟miR－18a 調控血管生成過程中哪些分子或者信號通路起關鍵性介導作用?尚有待進一步研究證實。

關于miR－17 ～92 家族對血管生成及對腫瘤發生和進展的影響，一直存在較大爭議。miR－17 ～92家族曾一度被認為是促癌的microRNA，即oncomiR［3］，因為最初的很多研究發現其在腫瘤中高表達并可促進腫瘤的增殖和血管生成，比如可通過下調抗血管生成因子TSP－1 及結締組織生長因子的表達而促進腫瘤組織的血管生成［10］。最新幾項研究證實，miR－17 ～92 家族成員對體外正常內皮細胞血管生成模型以及缺血或梗死整體的動物模型具有抑制血管生成作用［4－5］。我們推測這種完全相反的研究結果可能與所用研究模型即所采用的細胞或者血管生成所處的大環境密切相關。不同的病理、生理狀況下miR－17 ～92 家族成員的活性及調控機制可能并不完全相同。有研究發現miR－17 ～92 家族中的miR－17 和miR－20a，對于生理性血管再生模型和病理性的腫瘤血管生成模型表現出不同的效應［5，11］。對于腫瘤細胞，miR－17 ～92 家族成員增加了其旁分泌的促血管生成物質的活性，這可能削弱了其對于正常內皮細胞的抗血管生成作用［5］。

血管生成過程是由促血管生成和抗血管生成信號平衡嚴格調控。而miR－18a 對血管生成的調控作用及其機制還并不十分清楚?，F有的腫瘤血管生成模型與生理狀況下的血管生成模型中miR－17 ～92 家族相反的調控效應需進一步深入研究。因為不同的背景下通過miR－18a 等miR－17 ～92 家族的靶向作用調節血管生成可能具有不同的意義，一方面誘導血管生成可改善血管閉塞性疾病引起的缺血性損傷;而另一方面，抑制血管生成被證明是抑制腫瘤生長的可行策略。

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