羊耳菊抗菌物質(zhì)及其抑菌特性分析

謝慧婷，王 靜，陳振東，2，袁高慶* ，黎起秦，林 緯

1 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧530004;2廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，南寧530007

羊耳菊Inula cappa (Buch.-Ham.)DC.為菊科旋覆花屬植物，主要分布于熱帶和亞熱帶的亞洲國家，位于亞高山、低山、干燥或濕潤丘陵地、荒地、草地等。羊耳菊是傳統(tǒng)的藥用植物，含有多種有效活性成分，在醫(yī)藥藥理作用和臨床醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用研究得比較廣泛，已報道該植物所含化學(xué)成分有揮發(fā)油類、萜類、甾體類、有機酸類、芳香化合物、酰胺類、黃酮類、醇類、蒽醌類、香豆素類等［1］。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，平新亮等［2］曾報道羊耳菊甲醇提取物對菜青蟲3 齡幼蟲具有殺蟲活性，藥后72 h 的校正死亡率為50%，而在農(nóng)用殺菌活性方面的應(yīng)用迄今未見報道。

在前期篩選抑菌植物時，本文作者發(fā)現(xiàn)羊耳菊莖部甲醇提取物對水稻紋枯病菌具有較強的抑制作用。水稻紋枯病由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)引起，是遍及全球的水稻重要病害，目前多采用抗生素和化學(xué)藥劑防治。在過去的30 年里，大量持續(xù)的使用井岡霉素已導(dǎo)致我國水稻紋枯病菌產(chǎn)生一定的抗藥性［3］，研究和開發(fā)新型生物藥劑是一項水稻生產(chǎn)中亟待解決的問題。植物源農(nóng)藥因其生物活性高、安全性高、易降解、與環(huán)境相容性好、不易引起抗性等優(yōu)點，成為當(dāng)今國內(nèi)外植保工作者的研究熱點之一。植物源農(nóng)藥的種類包括植物源殺蟲劑、植物源殺菌劑和植物源除草劑。我國地大物博，植物種類繁多，豐富的植物資源為植物源殺菌劑的研究提供了充足的資源保障。

本試驗以水稻紋枯病菌為對象，對羊耳菊中的活性物質(zhì)進行分離鑒定并測定分析其抑菌特性，以期為利用該抗菌物質(zhì)開發(fā)防治水稻紋枯病的植物源殺菌劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

羊耳菊采自廣西金秀瑤族自治縣。羊耳菊莖部陰干粉碎后備用。

1.2 供試植物病原菌

供試植物病原真菌有:水稻紋枯病菌(R. solani)、杧果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. niverum)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、玉米小斑病菌(Bipolaria maydis)、茉莉枝枯病菌(Phoma putaminum)、番茄白絹病菌(Sclerotium rolfsi)、香蕉炭疽病菌(C.musae)、香蕉假尾孢葉斑病菌(Pseudocercospora musae)、香蕉彎孢霉葉斑病菌(Curvularia lunata)、柑桔褐色蒂腐病菌(Phompsis cytosporella)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、煙草黑脛病菌(Phytophthora nicotianae)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、甘藍黑斑病菌(Alternaria brassicae)。

植物病原細菌有:白菜軟腐病菌(Pectobacterium carotovora pv. carotovora)、辣椒青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、番茄瘡痂病菌(Xanthomonas vesicatoria)和木薯細菌性枯萎病菌(Xanthomonas axonopodis pv.manihotis)。

以上植物病原菌菌株均由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)研究室提供。病原真菌的培養(yǎng)除煙草黑脛病菌用燕麥瓊脂(Oat Meal Agar，OMA)培養(yǎng)基培養(yǎng)外，其他用馬鈴薯蔗糖瓊脂(Potato Sucrose Agar，PSA)培養(yǎng)基培養(yǎng);細菌用牛肉膏蛋白胨瓊脂(Nutrient Agar，NA)培養(yǎng)基和NA 培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.3 抑菌物質(zhì)的提取分離和鑒定

參照溶劑浸漬法［4］，用甲醇溶劑浸泡羊耳菊莖部干粉(6000 g)，真空抽濾，減壓濃縮，獲得抑菌物質(zhì)的粗提物(189.6 g)。取100 g 粗提物，采用液-液萃取法［4］，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇4 種有機溶劑對羊耳菊甲醇提取物的水溶液進行萃取，獲得各萃取物，測定其對水稻紋枯病菌的抑菌活性。

對具有較強抑菌活性的石油醚層萃取物(12.5 g)進行硅膠柱層析，石油醚-丙酮洗脫(100∶0、80∶1、40∶1、10∶1、1∶1)，最后甲醇沖柱，得到Fr.1～14，對水稻紋枯病菌具有抑菌活性的組分集中在Fr.4～9，將其合并，以石油醚-乙酸乙酯洗脫(100∶0、99∶1、98∶2、98∶3、98∶4、98∶6、1∶1)，最后甲醇沖柱，得到Fr.1～10，F(xiàn)r.3 為橙紅色精油，具有較強抑菌活性。以低溫冷凍結(jié)晶法［5］對其固體結(jié)晶物進行多次純化，最終獲得單體化合物(0.7 g)。采用波譜法對分離到的活性化合物進行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定。

1.4 抑菌特性測定

1.4.1 抑菌活性測定

對植物病原真菌的活性測定采用菌絲生長速率法［6］，具體操作步驟是:將供試菌物在PSA 或OMA平板上活化培養(yǎng)，待菌落長滿大半培養(yǎng)皿時備用。用溶劑溶解供試樣品，與PSA 或OMA 培養(yǎng)基混勻，倒入直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿，制成厚薄均勻的含藥帶毒平板培養(yǎng)基，以含相同濃度溶劑的培養(yǎng)基作為對照。用直徑為5 mm 的打孔器切取供試菌菌落邊緣菌餅，反向接入含藥帶毒平板中央，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)對照菌落剛好長滿培養(yǎng)皿時，用十字交叉法測量菌落直徑(mm)，以下列公式計算供試樣品對植物病原真菌的抑菌率。每處理均3 次重復(fù)。

抑菌率(%)= 100 ×(對照菌落直徑–處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-5)

采取抑菌圈法［6］測定供試樣品對植物病原細菌的抑菌活性。將25 mL 含有107CFU/mL 供試細菌的NA 培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，用滅菌的5 mm 打孔器打孔，每孔加入供試樣品藥液50 μL，同時以相同濃度的溶劑作為對照，置于28 ℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)48 h。每個處理3 次重復(fù)，十字交叉法測量抑菌圈的直徑，取平均值。

1.4.2 毒力測定

將供試樣品稀釋成一系列濃度梯度，采用菌絲生長速率法測定其對水稻紋枯病菌的抑菌率。將藥劑濃度取對數(shù)值作為橫坐標(biāo)(x)，抑菌率換算成生物統(tǒng)計概率值作為縱坐標(biāo)(y)，采用DPS v8.01 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，以回歸分析法計算抑菌中濃度(EC50)。

1.4.3 抑菌化合物的穩(wěn)定性測定

將抑菌化合物置于不同的酸堿度(pH)、溫度、紫外光和熒光等條件下處理?；衔镌趐H 值分別為1、3、5、7、9、11、13 的溶液中靜置24 h;化合物藥液分別置于0、20、40、60、80、100 ℃環(huán)境里恒溫處理1 h;置于600 Lx 紫外燈下分別照射2、4、6、8、10 h;置于6000 Lx 日光燈下分別照射12、24、48、72、96 h。各條件處理的化合物均配制成50 mg/L 的藥液，采用菌絲生長速率法測定其對水稻紋枯病菌的抑菌活性。以相同濃度的未經(jīng)處理的化合物作為對照。

1.4.4 抑菌化合物的抑菌譜測定

抑菌化合物的質(zhì)量濃度均為100 mg/L，以菌絲生長速率法測定其對16 種植物病原真菌的抑菌活性;以抑菌圈法測定其對4 種植物病原細菌的抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同萃取物對水稻紋枯病菌的抑菌活性分析

石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取物對水稻紋枯病菌的抑菌中濃度分別為135.20、1123.60 和3886.45 mg/L，正丁醇和水萃取物沒有抑菌活性。結(jié)果表明，羊耳菊對水稻紋枯病菌的抑菌活性物質(zhì)主要存在于石油醚萃取物中。

2.2 抑菌化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

將石油醚萃取物進行硅膠柱層析分離和低溫冷凍純化，得到白色顆粒狀化合物，對水稻紋枯病菌的菌絲生長具有強烈抑制作用，抑菌中濃度為47 mg/L。該化合物的波譜數(shù)據(jù):1H NMR (600MHz，CDCl3)δ:7. 098～7. 085 (d，1H，-CH-)，6. 750～6.737 (d，1H，-CH-)，6.589～6.587 (s，1H，-CH-)，4.595 (s，1H，OH)，3.205～3.136 (m，1H，-CH-)，2.2849 (s，3H，-CH3)，1.260～1.248 (s，6H，-CH3);13C NMR (300 MHz，CDCl3)δ:152.516，136.612，131.293，126.238，121.681，116.022，26.737，22.671，20.857。與相關(guān)文獻對照［7，8］，確定其為5-甲基-2-異丙基酚，即百里香酚(Thymol)，分子式為C10H14O。

2.3 百里香酚的抑菌活性穩(wěn)定性

不同pH 值溶液和不同溫度處理的百里香酚對水稻紋枯病菌的抑菌活性與對照一致;經(jīng)紫外光和熒光照射不同時間后，百里香酚對水稻紋枯病菌的抑菌活性沒有發(fā)生變化，說明百里香酚的穩(wěn)定性較好。

2.4 百里香酚的抑菌譜

在16 種供試植物病原真菌中，除了對甘藍黑斑病菌的菌絲生長具有微弱的促進作用外，100 mg/L的百里香酚對其他15 種真菌均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用(見表1)，其中對水稻紋枯病菌、茉莉枝枯病菌、煙草黑脛病菌和香蕉彎孢霉葉斑病菌均表現(xiàn)出強烈抑制活性，它們的抑菌率沒有顯著差異;對瓜果腐霉、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌和番茄白絹病菌也具有較強的抑制作用，抑菌率大于70%;對西瓜枯萎病菌、杧果炭疽病菌和香蕉假尾孢葉斑病菌的抑菌活性相對較弱，抑菌率小于50%。

4 種供試植物病原細菌中，百里香酚對白菜軟腐病菌和木薯細菌性枯萎病菌的抑菌活性較強，抑菌圈直徑分別為16.62 和15.52 mm，對辣椒青枯病菌和番茄瘡痂病菌表現(xiàn)出微弱的抑菌活性(見表2)。

表1 百里香酚對植物病原真菌的抑菌活性Table 1 Antifungal activity of Thymol against plant pathogenic fungi

表2 百里香酚對植物病原細菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of Thymol against plant pathogenic bacteria

3 討論

本研究采用生物活性追蹤法，發(fā)現(xiàn)羊耳菊抑制水稻紋枯病菌的活性物質(zhì)主要存在于其甲醇提取物的石油醚萃取層，通過反復(fù)硅膠柱層析，從中分離純化出對水稻紋枯病菌具有較強抑菌活性的化合物，抑菌中濃度是47 mg/L，經(jīng)鑒定為百里香酚。

百里香酚(5-甲基-2-異丙基酚)，又名麝香草酚，具特殊香氣，存在于多種植物的精油中，有殺菌、抗氧化、消炎、祛痰、去蛔和除螨等活性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、香料業(yè)、食品業(yè)、化妝品業(yè)等行業(yè)［9］。雖然該化合物的理化性質(zhì)和功能都已比較明確，但對植物病原菌的活性研究甚少。張靜等［10］曾報道從地椒(Mongollian Thyme)中分離得到的百里香酚對番茄灰霉病菌、棉花立枯病菌、水稻紋枯病菌、辣椒疫霉病菌、小麥紋枯病菌、稻瘟病菌和煙草赤星病菌均具有很強的抑制作用。Ji 等［11］發(fā)現(xiàn)，將百里香酚作為熏蒸劑處理土壤后，對番茄青枯病取得明顯的防治效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，從羊耳菊中分離得的百里香酚經(jīng)過不同的酸堿度、溫度、紫外光和熒光等條件處理后，其抑菌活性仍較穩(wěn)定。該化合物除了對供試的甘藍黑斑病菌沒有抑菌活性外，對其他15 種植物病原真菌和4 種植物病原細菌均具有抑菌活性。綜合本文及別人的研究結(jié)果表明，百里香酚抑菌譜廣，活性穩(wěn)定，具有防治多種植物病害的潛力和開發(fā)成植物源殺菌劑的應(yīng)用前景。

致謝:本文采集的羊耳菊由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院黎樺副教授鑒定，在此表示衷心的感謝!

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