從蚯蚓中聯合提取抗氧化酶SOD、CAT 的方法研究

廖 怡，榮永海，榮 龍

北京航空航天大學生物與醫學工程學院，北京100191

蚯蚓又稱地龍，屬寡毛綱環節動物門，在我國傳統中藥學中具有解熱、鎮痙、活絡、平喘等眾多藥理作用，蚯蚓入藥在我國已流傳千年。近年來研究發現，蚯蚓體內含有豐富的活性成分，對蚯蚓的研究成為生物化學及藥物生物技術領域的熱點。目前，對于蚯蚓活性成分的研究主要集中在蚯蚓纖溶酶、抗腫瘤蛋白［1］、抗菌肽［2］等的提取純化與分析。其中，纖溶酶(俗稱蚓激酶)由于其特異的溶血栓功效，成為新一代溶栓藥物并成功應用到西藥中。相關研究表明，蚯蚓體內也含有豐富抗氧化酶類。抗氧化酶是一類具有重要生理功能的酶，它們能及時清除體內剩余的氧自由基，在治療疾病、延緩衰老等方面具有重要作用。如果從蚯蚓體內有效提取出此類功能酶，并應用到工業生產中，這將拓寬蚯蚓的應用范圍，對蚯蚓的綜合開發利用具有重要意義。

目前，研究者們已從酵母、芽孢桿菌、重組大腸桿菌、黑曲霉等中分離純化出CAT，從細菌、真菌、原生動物、藻類、昆蟲、魚類、植物和哺乳動物等生物體內純化得到SOD。但是這些研究都僅限于SOD或CAT 單個酶的分離純化，并未見兩酶聯合提取的報道。本研究使用閃式提取技術及羧甲基纖維素(CM-22)離子交換層析從蚯蚓中聯合提取SOD 和CAT，并通過柱層析等手段對蚯蚓SOD、CAT 進行純化。聯合提取方法的建立不僅節約了資源、提高了原料利用率，也拓寬了蚯蚓的應用范圍、為蚯蚓多種活性成分的綜合開發利用創造了條件，為產業化奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

實驗用赤子愛勝蚯蚓(Eisenia fetida)由天津蚓福生物科技開發有限公司提供;羧甲基纖維素CM-22(Carboxymethyl Cellulose，CM)購自英國Whatman公司;二乙胺基乙基纖維素(DEAE-Cellulose)購自上海試劑二廠;葡聚糖凝膠G-200(Sephadex G-200)、葡聚糖凝膠G-75(Sephadex G-75)購自美國Pharmacia 公司;SOD 活性檢測用鄰苯三酚購自國藥集團化學試劑有限公司;CAT 活性檢測用鉬酸銨購自天津市光復科技發展有限公司;蛋白檢測用考馬斯亮藍G-250 購自美國Amresco 公司:電泳試劑盒購自北京賽馳生物科技有限公司;SOD 標準品購自美國Sigma-Aldrich 公司;CAT 標準品購自德國Serva公司;其余試劑均從北京鼎國生物技術有限責任公司購買;全部試劑均為分析純或色譜純等級;所有溶液均以雙蒸水配制而成。

1.2 主要儀器與設備

SP-756P 型分光光度計，上海光譜儀器有限公司;ArantiTMJ-25 型低溫高速離心機，美國Beckman Coulter 公司;FC-95A 自動餾分收集器，北京新技術應用研究所;蛋白分離純化層析柱，上海錦華層析設備廠;JHBE-50S 型閃式提取器，北京金鼐科技發展有限公司;868 型酸度計，美國Orion 公司;雙蒸水過濾器，美國PALL 公司。

1.3 方法

1.3.1 蚯蚓的預處理

取270 g 新鮮冷凍蚯蚓(已洗凈)平均分為3份，剪碎，每份以1 ∶4(m/V)的比例加入已預冷的2.5 mmol/L pH 7.0 磷酸緩沖液中。分別用閃式提取(轉速5500 rpm，提取4 次，每次30 s，每次間歇5 min)、超聲波提取(組織搗碎后超聲波提取2 次，功率800 W，每次30 min)和組織均漿(2 次，每次1.5 min)進行提取。提取完成后，檢測SOD 和CAT 的活性，置于-20 ℃冰箱冷凍12 h，取出融化，11000 ×g 4 ℃離心1 h，收集上清液即為SOD、CAT 粗提液。

1.3.2 SOD、CAT 粗品的分離

CM-22 離子交換柱填料按說明處理，裝柱后用0.05 mol/L pH 5.0 醋酸緩沖液平衡。粗提液用pH酸度計調pH 5.0，11000 ×g 4 ℃離心30 min，收集上清液，上清液上CM-22 柱(2.5 cm × 45 cm)，流速2 mL/min，收集未吸附上CM-22 柱的酶液即為SOD 粗提液，測定SOD 活性;CM-22 柱吸附酶液用0.05 mol/L pH 6.0 磷酸緩沖液洗脫，流速1 mL/min，收集洗脫液即為CAT 粗提液，測定CAT 活性，用2.5 mmol/L pH 7.6 磷酸緩沖液4 ℃透析12 h。

1.3.3 CAT 的純化

1.3.3.1 Sephadex G-200

透析后的CAT 粗提液用PEG-4000 濃縮，濃縮液上Sephadex G-200 柱(2.6 cm × 70 cm，填料按說明充分溶脹)，2.5 mmol/L pH 7.6 磷酸緩沖液進行平衡和洗脫，流速2.5 mL/h，每管收集5 mL。測定每管CAT 活性和蛋白質含量，收集活性較高的各管酶液，進行下一步純化。

1.3.3.2 DEAE-Cellulose

DEAE-Cellulose 離子交換柱填料按說明處理，裝柱后用2.5 mmol/L pH 7.6 磷酸緩沖液平衡。G-200 收集的CAT 粗提液上DEAE-Cellulose 柱(1.6 cm × 30 cm)，0.05 mol/L NaCl 溶液進行洗脫［3］，流速1 mL/min，收集洗脫液即為CAT 酶液。

1.3.4 SOD 的純化

1.3.4.1 丙酮沉淀

將SOD 粗提液按1∶1(V/V)進行丙酮沉淀［4］，置于-20 ℃15 min 后離心，11000 × g 4 ℃離心30 min，棄去上清，沉淀用2.5 mmol/L pH 7.6 磷酸緩沖液溶解，測定SOD 活性，2.5 mmol/L pH 7.6 磷酸緩沖液4 ℃透析12 h。

1.3.4.2 DEAE-Cellulose

DEAE-Cellulose 裝柱后用2.5 mmol/L pH 7.6磷酸緩沖液平衡。透析后的SOD 酶液上DEAE-Cellulose 柱(1.6 cm × 30 cm)，5 mmol/L～200 mmol/L pH 7.6 磷酸緩沖液進行梯度洗脫［4］，流速20 mL/h，每管收集5 mL。測定每管SOD 活性和蛋白質含量，收集活性較高的各管酶液，2.5 mmol/L pH 7.6磷酸緩沖液4 ℃透析12 h。

1.3.4.3 Sephadex G-75

透析后的SOD 酶液用PEG-4000 濃縮后上Sephadex G-75 柱(1.6 cm × 80 cm，填料按說明充分溶脹)，流速20 mL/h，每管收集5 mL。測定每管SOD 活性和蛋白質含量，收集活性較高的各管酶液，得到蚯蚓SOD 純品。

1.3.5 蚯蚓SOD、CAT 提取和純化總工藝

1.3.6 SOD 活性測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定SOD 活性，參考文獻［5］，略有改進。以每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率50%所需的酶量為1 個酶活單位。

1.3.7 CAT 活性測定

［6］略有改動，以過氧化氫為底物，采用鉬酸銨終止法進行測定。以每分鐘催化分解1 μmol 過氧化氫所需的酶量為1 個酶活力單位。

1.3.8 蛋白質濃度的測定

蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定［7］，以標準牛血清蛋白做標準品繪制蛋白標準曲線。

1.3.9 SOD 純度鑒定及亞基分子量的測定

采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行SOD 的純度鑒定并測定其亞基分子量，分離膠質量分數為12%，濃縮膠質量分數為5%。

1.3.10 CAT 活性染色、純度鑒定及分子量的測定

參考董泗建等［8］的方法，略有改進，對CAT 進行活性染色。采用native-PAGE 進行CAT 的純度鑒定，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定其亞基分子量，分離膠和濃縮膠質量分數分別為8%、5%。

1.3.11 熱穩定性

在含0. 05 mol/L pH 7. 0 磷酸緩沖液中，將SOD、CAT 酶液分別至于25、35、45、55、65、75 ℃水中，水浴30 min，測定酶活性。

1.3.12 pH 值穩定性

將SOD、CAT 酶液分別置于0.05 mol/L 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 3-8)、0.05 mol/L 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9-10)、0.05 mol/L 磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液(pH 11-12)中，經40 min 后分別測定其酶活性。

1.3.13 最適pH 值

將CAT 酶液置于用0.05 mol/L 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 3-8)、0.05 mol/L 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9-10)、0.05 mol/L 磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液(pH 11)配置成的0.05 mol/LH2O2中反應，計算反應后酶活性。

2 實驗結果

2.1 蚯蚓SOD、CAT 粗品提取及分離

在此前的研究中，我們采用閃式提取法對羅漢果多酚［9］、羅漢果甜甙［10］、柑橘檸檬苦素［11］等生物活性成分進行提取，提取效率均高于傳統提取方法。本研究將閃式提取法與超聲波提取法、組織勻漿提取法等傳統方法進行比較，結果如表1 所示，閃式提取法具有最高的蚯蚓CAT 收率，超聲波提取蚯蚓SOD 的收率略高于閃式提取。但是由于完成一次超聲波提取的時間為1 h，這遠遠長于閃式提取法所需的2 min，從活性收率和節能高效方面綜合考慮，本研究采用閃式提取法對蚯蚓SOD、CAT 進行提取。

表1 不同提取方法酶收率的比較Table 1 Comparison of extraction methods

閃式提取之后的SOD、CAT 粗提液冷凍過夜，融化，測定粗提取液中SOD、CAT 的活性及比活(表2、表3)。粗提液上CM-22 柱，對SOD、CAT 進行分離，CM-22 柱未吸附溶液為SOD 粗提液，酶活性回收率為88.23%(表3)，CM-22 柱吸附后洗脫溶液為CAT 粗提液，酶活性回收率為69.5%(表2)，CM-22離子交換層析柱對SOD、CAT 具有良好的分離效果。

2.2 蚯蚓CAT 的純化

CAT 粗提液經Sephadex G-200 凝膠過濾層析后，結果如圖2 所示，收集活性高峰，得到比活6903 U/mg 的蚯蚓CAT。收集后的溶液上平衡好的DEAE-Cellulose 柱，得到比活22606 U/mg 的蚯蚓CAT。純化后的蚯蚓CAT 活性高于市售黑曲霉CAT(≥4000 U/mg protein，Sigma-Aldrich Co.，USA)，牛肝CAT(2000～5000 U/mg protein，Sigma-Aldrich Co.，USA)，但是與人紅細胞CAT(≥30000 U/mg protein，≥90%電泳純，Sigma-Aldrich Co.，USA)相比還有一定差距。

圖2 蚯蚓CAT 的G-200 洗脫曲線Fig.2 Separation of earthworm CAT on Sephadex G-200 column

表2 蚯蚓CAT 純化結果Table 2 Purification of earthworm CAT

2.3 蚯蚓CAT 的活性染色、純度鑒定及分子量的測定

純化后的CAT 用native-PAGE 鑒定純度，最終顯示2 條主帶。用鐵染色法對非變性電泳條帶進行活性染色，染色結果表明，分子量較大的主帶具有CAT 活性，并且與牛肝CAT 其中一條CAT 酶帶對應(圖3)，分子量較小的主帶不具有CAT 活性，分析其原因可能是:1.在純化過程中此分子量的CAT失活;2.此條帶蛋白為雜蛋白。此蛋白的特征還有待進一步探究。此外，根據文獻報道，過氧化氫酶在生物體內形態多樣，如蘋果含1 種CAT［3］，而嗜溫性沙雷氏菌則含3 種不同分子量CAT［12］，因此本研究提取出的蚯蚓CAT 可能只是蚯蚓體內其中的一種CAT 活性組分。

通過SDS-PAGE 測得此CAT 亞基分子量約為72 kD，而CAT 由4 個相同亞基組成，據此推測本研究提取出的蚯蚓CAT 分子量約為288 kD，這與Switala［13］等的研究相符(CAT 分子量一般為220～340 kD)。

圖3 蚯蚓CAT 的活性染色，非變性電泳和SDS 變性凝膠電泳結果Fig.3 Active staining of purified earthworm CAT，Native-PAGE and SDS-PAGE analysis

2.4 蚯蚓SOD 的純化

經離子交換層析柱CM-22 分離后的SOD 粗提液按1∶1(V/V)進行丙酮沉淀，如表2 所示，沉淀溶解后測得其比活為645.5 U/mg(表2)，將溶液透析12 h。透析后的溶液上DEAE-Cellulose 離子交換層析柱，結果如圖4 所示，收集活性峰，得到比活3532 U/mg 的SOD 酶液(表3)。經DEAE-Cellulose 純化后的SOD 酶液用2.5 mmol/L pH 7.6 磷酸緩沖液在4 ℃條件下透析12 h，濃縮后上Sepahdex G-75 凝膠過濾層析柱，結果如圖5 所示，收集活性峰，最終得到比活9352 U/mg 的SOD 純品，活性回收率為18.44%(表3)。純化的蚯蚓SOD 比活高于市售牛紅細胞SOD 標準品(2500～7000 U/mg，Sigma-Aldrich Co.，USA)，并且高于大部分文獻報道［4，14-18］。

圖4 蚯蚓SOD 的DEAE-Cellulose 洗脫曲線Fig.4 Separation of earthworm SOD on DEAE-Cellulose column

圖5 蚯蚓SOD 的G-75 洗脫曲線Fig.5 Separation of earthworm SOD on Sephadex G-75 column

表3 蚯蚓SOD 的純化結果Table 3 Purification of earthworm SOD

2.5 蚯蚓SOD 純度鑒定及亞基分子量的測定

純化后的蚯蚓SOD 經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析后為單一條帶，測得其亞基分子量約為17 kD，與SOD 標準品(Bovine erythrocytes，亞基分子量16.3 kD，全酶分子量32.5 kD)相似(圖6)。

圖6 蚯蚓SOD 的SDS 變性凝集電泳Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified earthworm SOD

2.6 蚯蚓SOD 的穩定性

2.6.1 SOD 的熱穩定性

結果如圖7 所示，蚯蚓SOD 酶活性在45 ℃時最高，在35 ℃～55 ℃之間具有較好的熱穩定性，與文獻報道相似(表4)，75 ℃時酶活力幾乎完全喪失。

圖7 蚯蚓SOD 的熱穩定性Fig.7 Thermal stability of earthworm SOD

2.6.2 SOD 的pH 值穩定性

結果如圖8 所示，蚯蚓SOD 的pH 值耐受范圍較廣，在pH 4～11 之間具有良好的穩定性，與南瓜、大蒜相似，優于紫草籽、黑豆來源的SOD 相似(表4)。當pH 值為3 時，SOD 幾乎完全失活。因此，我們在蚯蚓SOD 的提取及檢測過程中，pH 值始終保持在4～11 之間，以防止酶活性的丟失。

圖8 蚯蚓SOD 的pH 值穩定性Fig.8 pH stability of earthworm SOD

表4 蚯蚓SOD 與其他來源SOD 的穩定性比較Table 4 Comparison of SOD ability

2.7 蚯蚓CAT 的穩定性

2.7.1 CAT 的熱穩定性

結果如圖9 所示，不同于蚯蚓SOD 的是，CAT酶活性在35 ℃時最高，與貽貝、鴨肝來源的CAT 相似(表5)，在25 ℃～45 ℃之間具有較好的熱穩定性，65 ℃時酶活力幾乎完全喪失。結果表明，蚯蚓SOD 比CAT 具有更好的熱穩定性。

圖9 蚯蚓CAT 的熱穩定性Fig.9 Thermal stability of earthworm CAT

2.7.2 CAT 的pH 穩定性

結果如圖10 所示，蚯蚓CAT 的pH 值耐受范圍較廣，在pH 4～10 之間具有良好的穩定性，優于韭菜和粘質沙雷氏菌(表5)。我們在蚯蚓CAT 的提取及檢測過程中，pH 值保持在4～10 之間，以防止酶活性的大量丟失。蚯蚓SOD 和CAT 較廣的pH值耐受范圍，預示了其在實際應用中較強的pH 值適應性，具有很高的應用價值。

表5 蚯蚓CAT 與其他來源CAT 穩定性的比較Table 5 Comparison of CAT ability

2.7.3 CAT 的最適pH 值

蚯蚓CAT 的最適反應pH 值為6，與蘆薈、蘋果來源的CAT 具有一定差異(表5)，當pH 值小于4或大于11 時，相對酶活性下降至50%以下。所以，蚯蚓CAT 的最適pH 值為6～7 之間，我們在實驗中檢測CAT 酶活性時pH 值控制在6～7。

蚯蚓SOD、CAT 性質的測定為實驗中有效保持酶的活性、采用最佳提取及檢測條件提供了依據。此外，不同來源SOD、CAT 在性質上的差異也顯示出蛋白酶由于生物體環境不同而具有的生物多樣性。

3 結論

在本研究中，我們首次利用閃式提取技術使得CAT 的提取效率比傳統超聲波提取和組織勻漿提取分別提高14.4%、44.4%，SOD 的提取效率與組織勻漿法相比提高32.5%。閃式提取技術為蚯蚓的分離提取提供了一種高效的方法。同時也為蚯蚓體內其它活性成分(谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化物酶、葡萄糖氧化酶等)的充分開發利用創造了條件。

利用柱層析等方法對蚯蚓SOD、CAT 進行分離純化，收率分別達到18.44%和14.98%，得到比活9352 U/mg 的SOD，CAT 比活也達到22606 U/mg，分離純化效果良好。本研究成功實現了蚯蚓SOD、CAT 的聯合提取，不僅拓寬了抗氧化酶的生物來源，還提高了蚯蚓利用率，擴大了其應用范圍，使蚯蚓的綜合利用具有更好的經濟和社會效益。

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