超聲波輔助象拔蚌多糖提取及抗氧化活性研究

溫揚敏 ，邱丹纓，羅彩林，謝永華

1泉州醫學高等專科學校細胞生物學與醫學遺傳學教研室;2泉州醫學高等專科學校基礎醫學部，福建 泉州362011

海洋貝類含有豐富的營養物質，是新型的創新藥物和功能性食品資源［1］。貝類多糖是存在于貝類體內的一種生物活性物質，其結構和功能非常復雜。貝類多糖藥理作用與植物多糖相似，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗衰老以及增強免疫等作用［2-4］。象拔蚌(Panope generosa)，屬軟體動物，雙殼綱，海螂目，海螂屬，是遠東包括華人及日本人崇尚食用的高級海鮮，原產地在美國和加拿大北太平洋沿海。十九世紀九十年代，被引入中國開始人工養殖［5，6］。研究象拔蚌多糖的提取工藝以及抗氧化活性，對新型功能食品的開發以及象拔蚌活性物質的利用具有重要的理論和實踐價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

象拔蚌:購自福建泉州洛江農貿市場。羥自由基測定試劑盒和總抗氧化試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。定性濾紙(whatman NO1001-110)，氯仿(AR，天津市化學試劑一廠)，正丁醇(AR，天津市登科化學試劑有限公司)，蒽酮(AR，上海邦成化工有限公司)，葡萄糖(AR，北京冬歌生物科技有限公司)，維生素C(阿特維斯(佛山)制藥有限公司，批準文號H44021227)，無水乙醇(西隴化工股份公司)，硫酸(西隴化工股份公司)。

1.2 實驗儀器與設備

分光光度計:SP-752 紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司。超聲波清洗機:VGT-1620QTD 型，深圳市興宏業投資有限公司。高速冷凍離心機:KDC-160HR，科大創新股份有限公司中佳分公司，冷凍干燥機:FD-1C-50，北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同超聲時間對象拔蚌多糖提取工藝影響

選擇殼長6～10 cm 新鮮象拔蚌成貝，去殼、洗凈、稱取其肌肉30 g，放入500 mL 燒杯，再加入固液比(g/mL)為1∶10 的雙蒸水。放置于超聲波清洗機(40 KHz，100 W)，分別于50 ℃水浴超聲波處理10、20、30、40、50 min，每組實驗設3 個平行。再用定性濾紙過濾，取濾液Sevag 法除蛋白。加入乙醇使最終乙醇濃度為80%，4 ℃過夜沉淀。6000 g 離心15 min 收集多糖，冷凍干燥［7］。

1.3.2 不同超聲溫度對象拔蚌多糖提取工藝的影響

稱取象拔蚌肌肉30 g，放入500 ml 燒杯，再加入固液比(g/mL)為1∶10 的雙蒸水。放置于超聲波清洗機(40 KHz，100 W)，分別于30、40、50、60、70℃水浴超聲波處理30 min，每組實驗設3 個平行。多糖提取同1.2.1。

1.3.3 不同固液比對象拔蚌多糖提取工藝的影響

稱取象拔蚌肌肉30 g，放入500 ml 燒杯，分別加入固液比(g/mL)為1∶3、1∶6、1∶9、1∶12、1∶15 的雙蒸水。放置于超聲波清洗機(40 KHz，100 W)，于60 ℃水浴超聲波處理30 min，每組實驗設3 個平行。多糖提取同1.2.1。

1.3.4 正交試驗優化象拔蚌多糖提取工藝

根據單因素實驗結果，設計超聲溫度(50、60、70 ℃)、時間(20、30、40 min)和固液比(1∶6、1∶9、1∶12)三因素三水平正交實驗優化象拔蚌多糖提取工藝，每組實驗設3 個平行。多糖提取同1.2.1。

1.3.5 多糖測定

采用蒽酮比色法［8］測定多糖含量。標準曲線方程:y =0.4027x-0.0113，R2=0.9997。象拔蚌多糖提取率(%)=(象拔蚌多糖質量/象拔蚌肌肉質量)* 100%。

1.3.6 拔蚌多糖抗氧化活性測定

總抗氧化能力(T-AOC)檢測和羥自由基測定均嚴格按照南京建成生物工程研究所羥自由基測定試劑盒說明書操作。T-AOC 單位定義:在37 ℃時，每mL 多糖溶液每分鐘使反應體系的吸光度(OD)值，每增加0.01 時，為一個總抗氧化能力單位(U)。羥自由基抑制活性定義:規定在37 ℃下反應一分鐘，每mL 多糖溶液使反應體系中的H2O2濃度降低1 mmol/L 為一個抑制羥自由基能力單位(U)。

2 結果與分析

2.1 不同超聲時間對象拔蚌多糖提取率的影響

圖1 超聲時間對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of polysaccharides

超聲溫度對象拔蚌多糖提取率的影響見圖1。從圖1 可以看出當超聲波處理時間小于30 min 時，象拔蚌多糖提取率隨著超聲時間延長而增加，而當超聲時間大于30 min 時，多糖的提取率隨時間延長反而有所下降。當超聲波處理30 min 時象拔蚌多糖提取率最高，與超聲波處理時間小于10 min 比較存在極顯著差異(P ＜0.01)。其原因可能是超聲處理時間較短時，隨著時間增加有利于多糖的溶解。然而當超聲波處理時間過長，可能導致一些物質降解［9］。

2.2 不同溫度對象拔蚌多糖提取率的影響

圖2 超聲溫度對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of polysaccharides

超聲溫度對象拔蚌多糖提取率的影響見圖2。從圖2 可以看出，象拔蚌多糖提取率隨超聲溫度升高而逐漸增加，但隨著溫度進一步升高，象拔蚌多糖的提取率趨于平穩。與超聲溫度30 ℃比較，當溫度為60 和70 ℃時，象拔蚌多糖提取率均存在顯著差異(P ＜0.05)。超聲溫度為60 ℃時，象拔蚌多糖提取率最大，比超聲溫度為30 ℃時提高36.53%。其原因可能是隨著超聲溫度升高，能降低液體的黏度、增加接觸表面積、加速質量傳遞和空化作用等［10］。

2.3 固液比對象拔蚌多糖提取率的影響

圖3 固液比對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

不同固液比對象拔蚌多糖提取率的影響見圖3，從圖3 可以看出，當固液比小于1∶9 時，隨著加水量增加象拔蚌多糖的提取率迅速增高。但當固液比大于1∶9 時，繼續增加水量，象拔蚌多糖提取率趨于穩定。其原因可能是增加水量有利于多糖物質的溶解。但當加水量達到一定程度時，多糖已全部溶解，所以繼續增加水量多糖提取率不再增加。考慮到固液比大，會給后續工序帶來困難，消耗較多熱能，且長時間濃縮也會破壞多糖，綜合各方面考慮，適宜的固液比為1∶9。

2.4 正交實驗優化象拔蚌多糖提取工藝

表1 象拔蚌多糖提取的正交實驗Table 1 Orthogonal experiment of extracting polysaccharides from Panope generosa

注:實驗數據為三次試驗結果平均值

一方面，適宜條件的超聲處理能減小樣品顆粒大小和加速了樣品內部水分子擴散，且對樣品內部水分擴散系數的影響隨著超聲強度的增加而逐漸增強，從而提高多糖提取率。但另一反面，超聲波也可導致多糖分解［9，10］。所以確定多糖提取的超聲條件顯得至關重要。三因素三水平正交實驗優化象拔蚌多糖提取實驗結果見表1，從表1 可以看出影響多糖提取的首要因素是加水量，其次是超聲時間和超聲溫度(C ＞B ＞A)。根據方差分析(表2)，固液比對象拔蚌多糖提取率影響顯著(P ＜0.05)，而溫度和時間對象拔蚌多糖提取率有一定影響，但影響不顯著(0.10 ＞P ＞0.05)。象拔蚌多糖提取最佳工藝是超聲溫度60 ℃、超聲時間30 min、固液比為1∶12(A2B2C3)。

表2 象拔蚌多糖提取的正交實驗方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiment of extracting polysaccharides from Panope generosa

2.5 象拔蚌多糖總抗氧化活性測定

圖4 多糖的總抗氧化活性Fig.4 Total antioxidant activity of polysaccharides

抗氧化劑和抗氧化酶是人體本身能不斷產生的防御自由基損害的物質。有些抗氧化劑可以達到防御疾病、延緩衰老的目的。不同濃度的象拔蚌多糖總抗氧化活性見圖4。從圖4 可以看出，象拔蚌多糖的總抗氧化活性隨濃度升高而增加。象拔蚌總抗氧化活性與多糖濃度有明顯的量效關系。當濃度低于0.05 mg/mL 時，象拔蚌多糖總抗氧化活性高于Vc，而隨著濃度增加，Vc 總抗氧化活性明顯高于象拔蚌多糖。

2.6 象拔蚌多糖清除自由基活性測定

圖5 多糖的羥自由基清除活性Fig.5 Capability to scavenge hydroxyl radicals of polysaccharides

羥自由基(·OH)是已知活性氧中對生物體毒性最強的一種自由基，過多羥自由基能殺死紅細胞，降解DNA、細胞膜等。從天然產物中分離無毒、高效的清除羥自由基活性物質，并將其應用于醫藥、食品、化妝品等領域有重要現實意義［9］。從圖5 可以看出，在低濃度時，象拔蚌多糖清除羥自由基能力明顯低于Vc。但隨著濃度增加，象拔蚌多糖清除自由基能力顯著升高，當濃度增加到4 mg/mL 時，象拔蚌多糖清除自由基能力大于Vc。象拔蚌多糖羥自由基清除活性和濃度之間關系可用公式表示為:y =0.161x+0.431(R2=0.887)。

3 討論

超聲波作為一種特殊的能量形式，在液體中傳播時可以產生空化效應、機械效應和熱效應等。作為一種新技術在中草藥有效成分的提取、藥物制劑工藝的改進、藥物的合成與降解、以及在生物藥劑等方面的運用中倍受青睞［11］。近年來，超聲波已廣泛應用于不同植物多糖［9］和貝類多糖的提取［12］。超聲輔助法能提高生物多糖的提取效率，其機制主要包括兩個方面:一方面超聲波能加速細胞破碎，另一方面超聲波能加速細胞內物質溶解速度［10］。

Denham Harman 衰老的自由基學說，認為衰老過程中的退行性變化是由于細胞正常代謝過程中產生的自由基的有害作用造成的。機體的組織細胞不斷產生的自由基積累結果，可使細胞中的多種物質發生氧化，損害生物膜。還能夠使蛋白質、核酸等大分子交聯，影響其正常功能［13，14］。天然抗氧化活性物質被人體吸收后，有的作為體內抗氧化酶類的誘導劑，提高體內相關抗氧化酶類水平，有的能直接清除自由基。天然抗氧化活性物質不僅能延緩衰老，還可通過增強機體免疫能力而達到抑制和消除腫瘤的功效。從海洋貝類獲取高效、價廉、低毒甚至無毒的天然抗氧化劑已取得重要進展［15，16］。本研究表明，不同濃度象拔蚌多糖均具體羥自由基清除能力和抗氧化活性，說明象拔蚌多糖還可能具有抗腫瘤活性。有關象拔蚌提取物的抗腫瘤活性，以及通過提高機體免疫能力和抗腫瘤關系有待進一步研究。

1 Adachi Y，Okazaki M，Ohno N，et al. Enhancement of cytokine production by macrophages stimulated with (1-3)-beta-D-glucan，grifolan (GRN)，isolated from Grifola frondosa.Biol Pharm Bull.1994，12:1554-60.

2 Woo ER，Kim WS，Kim YS. Virus-cell fusion inhibitory activity for the polysaccharides from various Korean edible clams.Archives Pharm Res，2011，6:514-517.

3 Li Z，Wan SL，Bao QH，et al.Isolation and characterization of antitumor polysaccharides from the marine mollusk Ruditapes philippinarum.Eur Food Res Tech，2008，1:103-110.

4 Zhan XD(湛孝東)，Wang KX(王克霞)，Li CP(李朝品).Advances on biological activities of Polysaccharides from shellfish.Lishizhen Med Mater Med Res(時珍國醫國藥)，2006，7:1285-1286.

5 Nielsen JK，Nielsen JK.Geoducks(Panopea abrupta)as isotopic bioarchives of seasonality in the climate of British Columbia.Biomed Life Sci，2009，5:987-995.

6 Zhang L(張良)，Ma GL(馬廣良). The artificial rearing technique of Panopea abrupta.China Fisheries(中國水產)，2003，9:60-61.

7 Hong Ye，Keqi Wang，Chunhong Zhou，et al.Purification，antitumor and antioxidant activities in vitro of polysaccharidesfrom the brown seaweed Sargassum pallidum. Food chemistry，2008，111:428-432.

8 Huang JH(黃建華)，Yuan DQ(袁道強). Biochemical Experiments(生 物化 學 實 驗). Beijing:Chemical Industry Press，2009.159-162.

9 Bao Y，Zhao MM，Shi J，et al. Effect of ultrasonic treatment on the recovery and DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from longan fruit pericarp. Food chemistry，2008，2:685-690.

10 Mircea Vinatoru. An overview of the ultrasonically assisted extraction of bioactive principles from herbs. Ultrasonics Sonochemistry，2001，3:303-313.

11 Chang MQ(常明泉)，Peng XY(彭小燕)，Chen XZ(陳學珍)，et al. Application of ultrasonic technology in development and research of medicament.Chin pharm Affairs，2009，12，1221-1223.

12 Chen M(陳檬)，Li HS(李和生).Technology for extracting amino acid from oyster with ultrasonic wave.Food Sci Tech，2006，312:41-43.

13 Denham Harman. Free radical theory of aging. Mutation Research/DNAging，1992，3:257-266.

14 Leanderson P，Faresjo AO，Tagesson C. Green tea polyphenols inhibits oxidant-induced DNA stand breakage in cultured lung cells.Free Radic Biol Med，1997，23:235-242.

15 Wen YM(溫揚敏)，Luo CL(羅彩林)，Chen SZ(陳淑增).Influence of extract from Coelomactra antiquata on antioxidant ability of normal mice.Sci Tech Food Ind，2011，5:371-372.

16 Cheng SW(程仕偉)，Yu XM(于曉明)，Zhang YX(張玉香).Study on extraction of polysaccharides from Mytilus edulis and their antioxidant activity in vitro.Sci Tech Food Ind，2010，9:132-134.