生物醫用透明質酸多糖的改性和功能化研究

吳莉嬌，欒 途，張 飛，張洪斌

上海交通大學 化學化工學院 高分子科學與工程系，上海200240

透明質酸(hyaluronic acid，HA)是一種天然聚陰離子粘多糖，由D-葡萄糖醛酸(glucuronic acid)和D-N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl glucosamine)以β-1，4 和β-1，3 糖苷鍵交替連接而成［1］，其化學結構如圖1 所示。HA 幾乎存在于所有的哺乳動物體中，通常以鹽的形式存在。在人體內HA 分布廣泛，例如在眼玻璃體、關節液、臍帶和皮膚中均存在較高濃度的HA，肺、腎臟、大腦和肌肉組織里也發現有HA的存在。人體不斷地合成，也在不斷地代謝HA。HA 在生物體中具有多種生理和機械功能，如保持水分、調節滲透壓、維持組織形態、屏障擴散、潤滑關節、緩沖應力等［2］。更為重要的是，HA 能夠被特定的細胞受體如CD44［3］識別，從而調控細胞的粘附、生長和分化，調控免疫反應、血管化和愈合等生理過程［4］。在具有上述重要生理功能的同時，由于HA在人體中是天然存在的，具有良好的生物相容性、生物降解性和非免疫原性，因此在醫學領域具有重要和廣泛的應用。

但是通過對HA 應用效果的研究(如對骨關節炎的治療和術后粘連的預防)發現，HA 無法提供持久的治療功效。這主要是由于HA 具有高水溶性，對自由基及透明質酸酶敏感，容易發生降解［5］。HA體內保留時間短，在水體系中缺乏力學強度［6］，限制了其應用，因此對HA 進行改性以提高其抗降解性和力學強度顯得尤為重要。許多學者對天然HA進行了化學修飾或復合改性，以彌補上述不足，研發出了具有一定力學強度、高穩定性的衍生物，其中部分衍生物已被廣泛應用于醫藥、食品和高級化妝品等領域。HA 可進行改性的基團包括羧基、羥基、乙酰氨基和還原末端。主要的化學改性方法有交聯、酯化、接枝等，而物理方法有復合改性。本文主要對近年的HA 改性研究及其醫學應用進行了詳細綜述。

圖1 透明質酸的分子結構Fig.1 The molecular structure of hyaluronic acid

1 交聯改性

交聯是HA 形成凝膠的最普遍的改性方式，可以發生交聯的最重要的基團是羧基和羥基。羥基通過醚鍵交聯，而羧基通過酯鍵交聯。交聯后，HA 分子量明顯增加，根據交聯程度的不同，交聯產物外觀上有明顯的差異。

1.1 羥基交聯

1.1.1 環氧化合物交聯

HA 可與多種環氧化合物在堿性條件下發生交聯反應，制備不同用途的凝膠。如Lebreton［7］采用1，4-丁二醇二縮水甘油醚、1，4-二(2，3-環丙氧基)丁烷及1，4-二縮水甘油丁烷等環氧化合物來交聯HA。Sakurai 等［8］采用多官能團環氧化合物交聯HA，交聯密度可達每1000 個HA 雙糖重復單元至少有5 個交聯的重復單元。與未交聯HA 相比，這種交聯物更能抵抗透明質酸酶的降解。

1.1.2 醛交聯

醛類是常用的交聯劑之一。HA 和雙醛的交聯反應被認為是通過形成縮醛和半縮醛基團而完成的［6］。HA 可以和戊二醛(GTA)發生化學交聯形成非水溶性膜［9］。然而，利用GTA 進行交聯制得的生物材料易引起鈣化并且毒性高，這主要是由于無法完全除去產物中殘留的GTA 所致。Ramires 等采用GTA 蒸汽做交聯劑，制備了交聯聚乙烯醇-HA 膜。使用GTA 蒸汽對HA 進行交聯被認為是一種有效的避免交聯劑殘留的方法［10］。

1.1.3 砜交聯

HA 與二乙烯基砜(DVS)可在堿性水溶液中發生交聯反應制得凝膠。DVS 交聯的凝膠具有高度生物相容性、非抗原性以及非免疫原性，力學性能也得到大幅提高，可用作組織工程的支架材料［11］。Sannino 等［12］利用DVS 交聯HA 和纖維素衍生物制備了具有微孔結構的水凝膠。該水凝膠對外部吸收媒介組分的變化很敏感，平衡吸收量比普通HA 凝膠高，有可能用于預防術后軟組織粘連。

1.2 羧基交聯

1.2.1 碳二亞胺(EDC)交聯

在酸性條件下，HA 與EDC 可發生交聯反應［13，14］。常用的EDC 交聯劑包括單碳二亞胺和雙碳二亞胺。EDC 交聯得到的HA 膜密度大、結構剛性強，因而抗透明質酸酶降解的能力得以增強［15］。Lu 等［16］對EDC 和GTA 交聯的HA 凝膠進行了對比，發現EDC 交聯的HA 凝膠膜的抗拉伸能力更高，表面也更光滑、細胞毒性更小。Lai 等［17］研究了EDC 交聯的HA 凝膠在鼠眼前房中的生物相容性發現，與GTA 交聯的膜相比，這種凝膠膜具有更好的眼部生物相容性。EDC 催化HA 交聯可制備具有不同形態的衍生物，如薄膜、凝膠和纖維，可用于載體或者組織工程支架的材料等，具有結構穩定、力學強度高、透明、細胞相容性好的特點。EDC 交聯HA 還有其顯著的優點:EDC 本身并不進入到最終產物中，僅作為交聯反應的催化劑;EDC 作為交聯劑細胞毒性小，后處理比常用的戊二醛簡單。

1.2.2 酰肼交聯

酰肼類化合物也是比較常用的交聯劑，酰肼的氨基與HA 的羧基可發生交聯反應［18］。經過酰肼交聯的HA 凝膠柔軟性、流動性和溶解性降低，力學性能則有明顯的提高。常用的酰肼包括單酰肼、二酰肼和多酰肼。二酰肼和多酰肼連接到HA 分子上后，酰肼多余的氨基不僅可以與HA 分子的其它羧基反應，發生分子內或者分子間交聯，或者和其他小分子或聚合物發生交聯反應，而且還可用于掛載藥物，從而可作為藥物載體［18］。此外，HA 與單酰肼和多酰肼反應可制備生化傳感器以及具有生物相容性的組織工程支架，還可用作防術后粘連的原位交聯凝膠的前體［19］。Motokawa 等［20］制備了一種新型的可持續釋放紅細胞生成素(EPO)的HA 凝膠。Luo等［21］先將HA 轉化成己二酸二酰肼衍生物，再用帶雙官能團的聚乙二醇-丙二醛作交聯劑制備出了可在幾秒內迅速膨脹、水化后柔軟的凝膠干膜。Shiseido 公司［22］用二酰肼交聯濃縮的HA，制備出不溶于水的HA 凝膠。該HA 凝膠在一定交聯度內是透明的，具有細胞毒性小、彈性適中、穩定和生物降解性高的優點，可注射進人體，并支持藥物釋放體系。

1.2.3 二硫化物交聯

Shu 等［23］采用二硫基丙二酰肼(DTP)和二硫基丁二酰肼(DTB)作為交聯制備了硫醇改性的HA 凝膠。Liu 等［24］采用Shu 等［23］的方法制備了二硫化物交聯的HA 膜并發現這種膜具有良好的細胞相容性，體外降解也很慢。

1.3 氨基交聯

HA 在交聯前先進行化學改性可形成其它化學反應基團。比如，HA 用酸或堿處理可導致部分N-乙酰氨基中的乙酰基脫乙酰化而形成自由的氨基。這種自由的氨基可大大拓展HA 結構修飾的途徑和方法。利用HA 脫乙酰基化后的游離氨基可進行交聯改性制備交聯產物［25，26］。京尼平(Genipin)是一種新型的交聯劑，可由傳統中藥杜仲的活性成分京尼平甙中水解得到，也可人工合成［27］。Genipin 可自發地與氨基發生反應，生成一個環烯醚萜氮化物，隨后經過脫水作用，形成一個芳香族單體，該單體可經由自由基反應形成環狀的分子間和分子內交聯結構［28］，用其交聯脫乙酰化HA 可制備環狀交聯的HA。Genipin 廣泛應用于生物制品中，但是也有其缺點，如其與氨基反應過程中，會生成一種深藍色的色素，限制了其在制備淺色、透明等產品中的應用，并且其價格也比較昂貴。

1.4 內部酯化交聯

HA 內部酯化衍生物是由HA 本身的羥基和羧基以分子內和分子間交聯的方式得到的。由于是通過內部反應得到，因此未引入外來分子。這種自交聯透明質酸(ACP)凝膠是完全生物相容的，體內駐留時間長，力學性能也得以改善［29］。Belluco 等［30］測試了ACP 凝膠的抗粘連作用，發現ACP 凝膠在1%濃度時就能防止腹部術后粘連。Pellicano 等［31］研究了ACP 凝膠在預防腹腔鏡子宮肌瘤剔除術后粘連的效用，發現ACP 確可作為潛在的防術后粘連劑。

2 非交聯改性

2.1 酯化改性

HA 的酯化改性在其羧基或羥基上進行的，通過部分和全酯化反應，可改善HA 的理化性質和生物功能，提高穩定性、溶解性。酯化HA 可通過擠出、冷凍干燥或者噴霧干燥而制成具有不同功能活性的材料，如薄膜、纖維、海綿、微球等。這類新型材料有望用于臨床的各個領域。此外，酯化類型和酯化程度也可影響這些材料的物理化學性質及生物特性［32］。

2.1.1 羥基酯化

丁酸鹽［33-35］能夠抑制人體腫瘤細胞生長，但其半衰期短，易經代謝排出體外。Speranza 等［36］通過丁酸和HA 的酯化反應制備了新型組蛋白脫乙酰基酶阻聚劑(HA-But)。含HA 的靶向藥物能夠聚集于表達CP44 的細胞表面并通過內容作用進入細胞［37］。研究表明，HA-But 是一種潛在的細胞靶向抗腫瘤劑，可用于治療原發性和轉移性腫瘤。最近發展的“生物打印機(bio-printer)”為解決器官移植帶來了希望［38］。生物打印機的“墨水”是細胞聚集體或者多細胞的合成細胞外基質，“紙”是可為“墨水”提供支架或者基質的聚合物。Skardal 等利用甲基丙烯酸化的透明質酸(HA-MA)和明膠的甲基丙烯酸乙醇酰胺衍生物(GE-MA)，采用兩步光交聯技術制備了HA-MA/GE-MA 凝膠。這種光交聯生物材料解決了組織工程中打印凝膠來源不足的問題［39］。

2.1.2 羧基酯化

紫杉醇是一種重要的抗腫瘤藥物，但單獨應用時具有很多缺點，如溶解性低、有一定毒性等［40］。為了克服這些缺陷，Lee［41］等制備了HA-紫杉醇化學軛合物，以獲得更好的藥物溶解性、穩定性、靶向性和控釋性。商品化的紫杉醇通常用蓖麻油/乙醇作為溶媒以增加其溶解性，但是也因此產生了很多副作用［42］。Rosato 等［42］制備了一種新型的水溶性紫杉醇-HA 結合物，由HA 的羧基和紫杉醇通過酯化反應合成。和傳統的紫杉醇相比，其水溶性大幅提高。

2.2 接枝改性

HA 的接枝反應是將小分子物質或聚合物接枝到HA 主鏈上。所形成的聚合物作為藥物載體，可充分利用HA 與細胞表面受體CD44 或其它HA 受體蛋白的結合能力，達到藥物靶向運送的目的。Huang 等［43］將低分子量瓊脂糖用表氯醇激活后和HA 接枝合成了瓊脂糖接枝的透明質酸(Ag-g-HA)，可作為胰島素釋放載體。Cho 等［44］利用EDC 和N-羥基琥珀酰亞胺做偶聯劑，將末端帶氨基的泊洛沙姆接枝到HA 上用于眼部藥物的載體。Pitarresi等［45］將HA 接枝到聚乳酸(PLA)和聚乙烯乙二醇(PEG)上，研制了自組裝兩性分子HA 接枝共聚物來包裹抗腫瘤藥物。Varghese 等［46］合成了一種新型胍基化試劑，并用其改性HA 制備非病毒性基因/siRNA 傳遞載體。Di Meo 等［47］通過點擊化學合成了兩種帶有碳硼烷的新型HA 衍生物，用于硼中子捕獲療法。Oldinski 等［48，49］將HA 與高密度聚乙烯(HDPE)接枝共聚，制備了有望用于組織修復的高分子共聚物材料。

2.3 疏水改性

Zhang 等［50］通過甲硅烷基化反應合成了一種新型HA 衍生物，增加了HA 的疏水性，增強了其在普通有機溶劑中的溶解性。Lapcik 等［51］也對HA 進行了疏水改性，結果顯示烷基化HA 大分子流變學性能有了明顯的改變。Charlot 等［52］合成了分別帶有β-環糊精和金剛烷的透明質酸支化衍生物。此兩種物質在水溶液中可以形成新型的“主-客”超分子自組裝復合物，并且表現出顯著的粘彈特性。

3 復合改性

3.1 與其它多糖復合

穩定蛋白質最常用的方法是凍干法，但是這種方法對蛋白質的結構和再水化后的活性具有不良的影響。Zhang 等［53］發現HA-海藻糖復合物是穩定胰激肽原酶(PKase)的有效輔料。Majima 等［54］制備了殼聚糖(CS)和HA 復合物，用做韌帶和肌腱組織工程支架材料。CS 和HA 還可通過離子作用自發形成納米粒子載體，包裹大分子藥物肝素，用于肺部釋藥［55］。臨床上，多佐胺(DH)和噻嗎洛爾(TM)可用于青光眼的治療，但其具有生物利用度低、藥物接觸時間短等缺點。Wadhwa 等［56］用HA/CS 納米粒子(CS-HA-NPs)裝載TM 和DH，與不含HA 的CSNPs 相比，CS-HA-NPs 造成的眼內壓力顯著下降，粘著強度和效率有大幅提高，更能滿足眼部釋藥載體的要求。Tan 等［57］將HA 引入殼聚糖-明膠(CSGel)體系，制成CS-Gel-HA 復合材料。這種復合材料可有效地縮短細胞在支架材料表面的適應期，抑制材料表面細胞的凋亡。

3.2 膠原蛋白復合

膠原蛋白是細胞外基質的一種主要結構蛋白，支持多種不同組織的生長，與HA 復合能賦予它良好的力學特性。Park 等［58］制備了經EDC 修飾的HA-膠原蛋白復合薄膜，該膜與用戊二醛作交聯劑制得的膜相比，對酶解的抵抗力大幅提高，含水量高達98%，無明顯細胞毒性，可用于組織工程中三維細胞培養的支架。

3.3 與聚乳酸-羥基乙酸共聚物(Poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)復合

PLGA 是一種獲美國FDA 批準可應用于人體的高分子合成材料［59］，具有良好的生物力學強度，容易加工，而且藥物控釋可持續幾天到幾個月，已廣泛用于組織工程支架等領域［60］。將HA 固定到多孔、可降解的PLGA 支架的表面，制成HA 改性的PLGA支架，可增強軟骨組織中軟骨細胞的粘附、增殖和分化［61］。

3.4 與超高分子量聚乙烯(UHMWPE)復合

UHMWPE 由于具有優良的機械性能、生物相容性和化學穩定性，因此在臨床上被用作人工關節軟骨-關節臼材料。但是此材料的抗磨性并不理想，在應用過程中會不斷產生微米尺寸磨屑，影響使用效果和壽命。Zhang 等［62，63］通過將UHMWPE 與硅烷化的HA 復合制備了一種微復合材料。經實驗測試，此種新型材料與不添加HA 的UHMWPE 聚乙烯材料相比最高可降低56%的磨損。

4 結論與展望

自從1934 年HA 被首次發現和制備以來，經歷了近八十年的研究與開發，人們對其結構、理化性質、生物功能已有了相對較明確的認識。隨HA 市場需求的與日俱增和臨床應用的推廣，針對不同用途的HA 及其改性衍生物的需求正不斷增大。目前，HA 研究和開發已成為材料學、生物學、病理學、免疫學、臨床醫學及生物組織工程學等多學科領域研究的熱點。HA 由于其獨特的理化性質和生理功能將得到更廣泛的應用。

眾多學者對HA 進行了物理改性和化學改性，在一定程度上克服了其易降解，在組織內停留時間短的缺點。以HA 為基礎的凝膠具有高度生物相容性，而且加工制備容易，因此這種材料在醫學上會有很大的應用潛力。在非高力學強度要求的應用領域，HA 凝膠材料已顯示出獨特的綜合性能優勢。但力學穩定性對組織工程材料而言十分重要，迄今為止還不能獲得具有滿意力學強度的HA 凝膠以適應各種應用需求。多糖基水凝膠在要求材料具有高韌性和抗疲勞性能的動態加載環境下仍處于劣勢。如何獲得完全無細胞毒性、高力學強度的HA 凝膠材料仍然是努力目標。相信未來一些年，HA 交聯產物及其衍生物的開發及應用將得到進一步地重視，HA 研究特別是交聯改性還會有更快、更深入的發展。

1 Necas J，et al. Hyaluronic acid (hyaluronan):a review. Vet Med，2008，53:397-411.

2 Balazs EA.The role of hyaluronan in the structure and function of the biomatrix of connective tissues. Struct Chem，2009，20:233-243.

3 Toole BP.Hyaluronan-CD44 interactions in cancer:paradoxes and possibilities.Clin Cancer Res，2009，15:7462.

4 Ling PX(凌沛學)，et al.Hyaluronan(透明質酸).Beijing:China Light Industry Press，2000:254-256.

5 Lapcik JrL，et al. Hyaluronan:preparation，structure，properties，and applications.Chem Rev，1998，98:2663-2684.

6 Collins MN，Birkinshaw C.Comparison of the effectiveness of four different crosslinking agents with hyaluronic acid hydrogel films for tissue-culture applications. J Appl Polym Sci，2007，104:3183-3191.

7 Lebreton PF. Soft tissue filler composition useful as dermal filler comprises hyaluronic acid component crosslinked with crosslinking agent e. g.1，4-butanediol diglycidyl ether;and anesthetic agent combined with crosslinked hyaluronic acid component.US2010028437-A1，2010.

8 Sakurai K，Ueno Y，Okuyama T.New crosslinked hyaluronic acid prods.for medical and cosmetic use，prepd. by reaction with polyfunctional epoxy cpd. EP161887-A2;JP60233101-A;JP61164558-A;JP61168362-A;JP61172808-A;JP61210034-A;US4716224-A;US4863907-A;DE3578961-G;EP161887-B;DE3583963-G;JP93074571-B;JP94011694-B2;JP94034814-B2;JP2501551-B2，1985.

9 Tomihata K，Ikada Y.Crosslinking of hyaluronic acid with glutaraldehyde.J Polym Sci，Part A:Polym Chem，1997，35:3553-3559.

10 Ramires PA，Milella E. Biocompatibility of poly(vinyl alcohol)-hyaluronic acid and poly(vinyl alcohol)-gellan membranes crosslinked by glutaraldehyde vapors. J Mater Sci:Mater Med，2002，13:119-123.

11 Ramamurthi A，Vesely I. Ultraviolet light-induced modification of crosslinked hyaluronan gels.J Biomed Mater Res，Part A，2003，66A:317-329.

12 Sannino A，et al. Cellulose derivative-hyaluronic acid-based microporous hydrogels cross-linked through divinyl sulfone(DVS)to modulate equilibrium sorption capacity and network stability.Biomacromolecules，2004，5:92-96.

13 Tomihata K，Ikada Y. Crosslinking of hyaluronic acid with water-soluble carbodiimide. J Biomed Mater Res，1997，37:243-251.

14 Sannino A，et al.Crosslinking of cellulose derivatives and hyaluronic acid with water-soluble carbodiimide. Polymer，2005，46:11206-11212.

15 Young JJ，et al. Preparation of cross-linked hyaluronic acid film using 2-chloro-1-methylpyridinium iodide or water-soluble 1-ethyl-(3，3-dimethylaminopropyl)carbodiimide. J Biomater Sci，Polym Ed，2004，15:767-780.

16 Lu PL，et al. Carbodiimide cross-linked hyaluronic acid hydrogels as cell sheet delivery vehicles:characterization and interaction with corneal endothelial cells. J Biomater Sci，Polym Ed，2008，19:1-18.

17 Lai JY，et al.Ocular Biocompatibility of Carbodiimide Cross-Linked Hyaluronic Acid Hydrogels for Cell Sheet Delivery Carriers.J Biomater Sci，Polym Ed，2010，21:359-376.

18 Prestwich GD，et al.Controlled chemical modification of hyaluronic acid:synthesis，applications，and biodegradation of hydrazide derivatives.J Controlled Release，1998，53(1-3):93-103.

19 Yeo Y，et al.In situ cross-linkable hyaluronic acid hydrogels prevent post-operative abdominal adhesions in a rabbit model.Biomaterials，2006，27:4698-4705.

20 Motokawa K，et al.Selectively crosslinked hyaluronic acid hydrogels for sustained release formulation of erythropoietin. J Biomed Mater Res，Part A，2006，78A:459-465.

21 Luo Y，et al.Cross-linked hyaluronic acid hydrogel films:new biomaterials for drug delivery.J Controlled Release，2000，69:169-184.

22 Kigota Y，Ueno N，Biocompatible hyaluronic acid gel and its application，JP 09059303，1997.

23 Shu XZ，et al. Disulfide cross-linked hyaluronan hydrogels.Biomacromolecules，2002，3:1304-1311.

24 Liu YC，et al. Biocompatibility and stability of disulfidecrosslinked hyaluronan films. Biomaterials，2005，26:4737-4746.

25 Crescenzi V，et al.New cross-linked and sulfated derivatives of partially deacetylated hyaluronan:Synthesis and preliminary characterization.Biopolymers，2002，64(2):86-94.

26 AEJ de Nooy，et al.Versatile synthesis of polysaccharide hydrogels using the Passerini and Ugi multicomponent condensations.Macromolecules，1999，32:1318-1320.

27 Mi FL，et al. Drug release from chitosan-alginate complex beads reinforced by a naturally occurring cross-linking agent.Carbohydr Polym，2002，48(1):61-72.

28 Sung HW，et al. Stability of a biological tissue fixed with a naturally occurring crosslinking agent (genipin). J Biomed Mater Res，2001，55:538-546.

29 Renier D，et al. Pharmacokinetic behaviour of ACP gel，an autocrosslinked hyaluronan derivative，after intraperitoneal administration.Biomaterials，2005，26:5368-5374.

30 Belluco C，et al.Prevention of postsurgical adhesions with an autocrosslinked hyaluronan derivative gel.J Surg Res，2001，100:217-221.

31 Pellicano M，et al.Effectiveness of autocrosslinked hyaluronic acid gel after laparoscopic myomectomy in infertile patients:a prospective，randomized，controlled study.Fertil Steril，2003，80:441-444.

32 Campoccia D，et al. Semisynthetic resorbable materials from hyaluronan esterification.Biomaterials，1998，19:2101-2127.

33 Mandal M，et al，Kumar R.Bcl-2 deregulation leads to inhibition of sodium butyrate-induced apoptosis in human colorectal carcinoma cells.Carcinogenesis，1997，18:229-232.

34 Tan S，et al.Proteome analysis of butyrate-treated human colon cancer cells (HT-29).Int J Cancer，2002，98:523-531.

35 Kamitani H，et al. Histone acetylation may suppress human glioma cell proliferation when p21WAF/Cip1 and gelsolin are induced.Neuro-Oncology，2002，4:95-101.

36 Speranza A，et al. Hyaluronic acid butyric esters in cancer therapy.Anti-Cancer Drugs，2005，16:373-379.

37 Platt VM，Szoka FC.Anticancer therapeutics:Targeting macromolecules and nanocarriers to hyaluronan or CD44，a hyaluronan receptor.Mol Pharm，2008，5:474-486.

38 Mironov V，et al.Bioprinting living structures.J Mater Chem，2007，17:2054-2060.

39 Skardal A，et al.Photocrosslinkable hyaluronan-gelatin hydrogels for two-step bioprinting. Tissue Eng，Part A，2010，16:2675-2685.

40 Leonelli F，et al.Design，synthesis and applications of hyaluronic acid-paclitaxel bioconjugates.Molecules，2008，13:360-378.

41 Lee H，et al. Hyaluronic acid-paclitaxel conjugate micelles:Synthesis，characterization，and antitumor activity. Bioconjugate Chem，2008，19:1319-1325.

42 Rosato A，et al. HYTAD1-p20:A new paclitaxel-hyaluronic acid hydrosoluble bioconjugate for treatment of superficial bladder cancer.Urol Oncol，2006，24:207-215.

43 Huang JY，et al.Synthesis of agarose-graft-hyaluronan copolymer and its potential application as a peptide carrier.J Appl Polym Sci，2010，117:3568-3574.

44 Cho KY，et al.Release of ciprofloxacin from poloxamer-grafthyaluronic acid hydrogels in vitro. Int J Pharm，2003，260:83-91.

45 Pitarresi G，et al.Self-assembled amphiphilic hyaluronic acid graft copolymers for targeted release of antitumoral drug. J Drug Target，2010，18:264-276.

46 Varghese OP，et al.Synthesis of Guanidinium-Modified Hyaluronic Acid Hydrogel. Macromol Rapid Comm，2010，31:1175-1180.

47 Di Meo C，et al.Novel types of carborane-carrier hyaluronan derivatives via "Click Chemistry".Macromol Biosci，2008，8:670-681.

48 Oldinski RA，et al.Synthesis and characterization of a Hyaluronan-polyethylene copolymer for biomedical applications. J Biomed Mater Res，Part B:Appl Biomater，2010，94:441-446.

49 Oldinski RA，et al.Dynamic mechanical analysis and biomineralization of hyaluronan-polyethylene copolymers for potential use in osteochondral defect repair.Acta Biomater，2010，7:1184-1191.

50 Zhang M，James SP. Silylation of hyaluronan to improve hydrophobicity and reactivity for improved processing and derivatization.Polymer，2005，46:3639-3648.

51 Lapcik L，et al.Chemical modification of hyaluronic acid:alkylation.Int J Polym Anal Ch，2010，15:486-496.

52 Charlot A，Auzély-Velty R.Synthesis of novel supramolecular assemblies based on hyaluronic acid derivatives bearing bivalent β-cyclodextrin and adamantane moieties. Macromolecules，2007，40:1147-1158.

53 Zhang Y，et al. Trehalose and hyaluronic acid coordinately stabilized freeze-dried pancreatic kininogenase.Eur J Pharm Biopharm，2007，65:18-25.

54 Majima T，et al. Chitosan-based hyaluronan hybrid polymer fibre scaffold for ligament and tendon tissue engineering.Proc Inst of Mech Eng，Part H:J Eng Med，2007，221:537-546.

55 Oyarzun-Ampuero FA，et al.Chitosan-hyaluronic acid nanoparticles loaded with heparin for the treatment of asthma.Int J Pharm，2009，381:122-129.

56 Wadhwa S，et al.Hyaluronic acid modified chitosan nanoparticles for effective management of glaucoma:development，characterization，and evaluation. J Drug Target，2010，18:292-302.

57 Tan H，et al.Gelatin/chitosan/hyaluronan ternary complex scaffold containing basic fibroblast growth factor for cartilage tissue engineering.J Mater Scie:Mater Med，2007，18:1961-1968.

58 Park SN，et al.Characterization of porous collagen/hyaluronic acid scaffold modified by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide cross-linking. Biomaterials，2002，23:1205-1212.

59 Klose D，Delplace C，Siepmann J. Unintended potential impact of perfect sink conditions on PLGA degradation in microparticles.Int J Pharm，2011，404(1-2):75-82.

60 Lee SY，et al.In vivo conjunctival reconstruction using modified PLGA grafts for decreased scar formation and contraction.Biomaterials，2003，24:5049-5059.

61 Yoo HS，et al.Hyaluronic acid modified biodegradable scaffolds for cartilage tissue engineering.Biomaterials，2005，26:1925-1933.

62 Zhang M，et al.A novel ultra high molecular weight polyethylene¨Chyaluronan microcomposite for use in total joint replacements. I. Synthesis and physical/chemical characterization.J Biomed Mater Res，Part A，2006，78:86-96.

63 Zhang M，et al.A novel ultra high molecular weight polyethylene¨Chyaluronan microcomposite for use in total joint replacements. II. Mechanical and tribological property evaluation.J Biomed Mater Res，Part A，2007，82:18-26.

64 Luan T，et al.A study on the nature of intermolecular links in the cryotropic weak gels of hyaluronan. Carbohydrate Polymers，2012，87:2076-2085.