藍莓葉水提物的體外抗氧化活性

朱曉紅，沈佳鑫，馬 瑞，徐麗珊

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004）

抗氧化劑是食品、醫藥等行業不可缺少的添加劑，它能阻止或延遲食品氧化，以提高食品的穩定性和保存期。目前，市場上的抗氧化劑主要分為天然抗氧化劑和化學合成抗氧化劑。由于化學合成抗氧化劑具有一定的毒性、致畸性和潛在的致癌性，使用過多會對人體健康造成重大危害。因此，尋找安全、高效的天然抗氧化劑成為近年來的一大研究熱點。天然抗氧化劑主要來源于植物，具有化學合成抗氧化劑所沒有的諸多優點。

藍莓（blueberry）又稱越橘，屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium.spp）多年生落葉或常綠灌木。大量研究表明，藍莓果中含有豐富的抗氧化物質，能延緩衰老[1]。但藍莓果產量較少，價格較昂貴，使藍莓果的試驗研究受到了一定程度的限制。因而，一些研究者近年來開始對藍莓葉進行研究，發現藍莓葉中同樣含有豐富的抗氧化物質[2]。而且在我國藍莓葉資源目前還沒有得到很好的利用。因此，開發藍莓葉中豐富的抗氧化物質具有廣闊的前景。國內外對藍莓葉的研究主要集中在抗氧化物質的提取和純化方面，對于抗氧化物質的體外抗氧化活性研究不多。

本試驗通過設定一定的濃度梯度對藍莓葉水提物的體外抗氧化活性進行研究，對研究藍莓葉中抗氧化物質及開發新型天然抗氧化劑具有重要意義[3]。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

試劑：維生素C（上海青析化工科技有限公司）、BHA、藍莓葉、磷酸鹽緩沖液（pH 值為6.6）、六氰合鐵酸鉀溶液、三氯乙酸、三氯化鐵溶液、DPPH（上海如吉生物科技有限公司）、FeSO4、水楊酸、H2O2、總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

儀器：恒溫烘箱、電子天平、旋轉蒸發器、恒溫水浴鍋、離心機、分光光度計、pH 計。

1.2 試驗方法

1.2.1 藍莓葉水提物提取 取一定量藍莓葉并剪碎，用料液比為1∶14 的藍莓葉與自來水混合，再用0.1 mol/L 的鹽酸調到pH 值為2.0，在100 ℃的沸水浴中提取60 min。將提取液旋轉蒸發濃縮，置于60 ℃烘箱中烘干，制成粉末備用[4]。

1.2.2 藍莓葉水提物含量測定 采用硫酸-香草醛法[5]和蘆丁法測定水提物中的原花青素和黃酮含量。

1.2.3 藍莓葉水提物還原力測定 取不同濃度藍莓葉水提物溶液2.5 mL 于試管中，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1%六氰合鐵酸鉀溶液。50 ℃水浴保溫20 min，快速冷卻，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，3 000 r/min 離心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.0 mL 蒸餾水、0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，充分混勻，靜置10 min 后，在700 nm 處測定吸光度值[6]。

1.2.4 藍莓葉水提物對DPPH·自由基清除活性的測定 DPPH·自由基（1，1-二苯基苦基苯肼）是一種人工合成的穩定自由基，其甲醇溶液顯紫色，在516 nm 處有最大吸收。當有自由基清除劑存在時，DPPH·的單電子由于被配對，其濃度減小而顏色變淺，在波長516 nm 處的吸光度值減小，對DPPH·自由基的淬滅能力可以有效地評價抗氧化劑的活性。DPPH·自由基清除活性測定參照文獻[7-10]進行。

DPPH·自由基的清除率計算公式為：GDPPH＝（1－（Ai－Aj）Ac）×100%。其中，GDPPH為清除率，Ai表示待測樣品液與DPPH 混合液在516 nm 處的吸光度值，Aj表示待測樣品液與無水乙醇混合液在516 nm 處的吸光度值，Ac表示無水乙醇與DPPH 混合液在516 nm 處的吸光度值。

1.2.5 藍莓葉水提物總抗氧化能力的測定 參照南京建成生物工程研究所生物總抗氧化能力（T-AOC）測試盒說明書進行。

2 結果與分析

2.1 藍莓葉水提物含量測定

2.1.1 原花青素標準曲線及其含量 采用硫酸-香草醛法，測得不同濃度的原花青素溶液在500 nm 處的吸光度值（圖1）。原花青素質量濃度在0～0.1 mg/mL 范圍內具有良好的線性關系。其回歸方程為y＝1.305 8x，R2＝0.998 1，其中，y為試驗所得的吸光度值（ABS），x 為樣品質量濃度（mg/mL）。根據回歸方程，對藍莓葉水提物溶液進行測定，通過計算得出藍莓葉水提物中原花青素含量為14.1%±0.9%。

2.1.2 蘆丁標準曲線及其含量 將蘆丁配制成不同濃度的溶液，并測定其在510 nm 處的吸光度值（圖2）。蘆丁質量濃度在0～25 μg/mL 范圍內具有良好的線性關系。回歸方程為y＝0.030 4x＋0.000 4，R2＝0.999 6，其中，y 為試驗所得的吸光度值（ABS），x 為樣品質量濃度（μg/mL）。根據回歸方程，對藍莓葉水提物溶液進行測定，通過計算得出藍莓葉水提物中黃酮含量為30.3%±0.1%。

2.2 藍莓葉水提物還原力測定

本試驗將不同的抗氧化劑配制成同一濃度梯度的溶液，用還原力測定方法分別測定其在700 nm 處的吸光度值。吸光度值越大，表示還原力越強（圖3）。

通過圖3 及T 檢驗分析發現，在6～36 μg/mL范圍內，BHA 和Vc 的還原力均高于藍莓葉水提物，且差異極顯著。不同抗氧化劑的還原力隨著濃度的增大而增強，且水提物隨著濃度的增大，還原力增強較緩；而Vc 和BHA 隨著濃度的增大，還原力增加較快。

將藍莓葉水提物分別與Vc，BHA 等質量配制成12 μg/mL 的混合溶液，測定混合物的還原力（表1）。

表1 混合物還原力比較

表1 中的還原力數據經T 檢驗分析表明，（6 μg Vc＋6 μg 水提物）/mL 混合溶液的還原力均高于12 μg/mL Vc 的還原力和12 μg/mL 水提物的還原力，且差異極顯著。說明了Vc 和藍莓葉水提物之間存在協同作用。但BHA 與水提物按等質量混合配成（6 μg BHA＋6 μg 水提物）/mL混合溶液時，其還原力小于12 μg/mL BHA 的還原力，但大于6 μg/mL BHA 的還原力，且差異均達極顯著水平。由此說明，我們可以通過增加水提物的量，減少BHA 的量來達到相同的還原效果。

2.3 藍莓葉水提物對DPPH·自由基的清除作用

試驗測定了藍莓葉水提物、BHA 和Vc 在同一濃度梯度時，對DPPH·自由基的淬滅能力，其結果如圖4 所示。

經過圖4 以及T 檢驗分析發現，在2.5～15.0 μg/mL 質量濃度范圍內，藍莓葉水提物對DPPH·自由基的清除能力均小于Vc 和BHA，且差異極顯著。藍莓葉水提物的清除率在10%～50%之間，清除率與水提物濃度之間近似正比例關系。但BHA 和Vc 在質量濃度超過10 μg/mL時，它們的清除率增加不再明顯，基本穩定在90%以上。

將Vc，BHA 和藍莓葉水提物按等質量配制成5 μg/mL 的混合液，測定其對DPPH·自由基的清除率。表2 結果經T 檢驗分析表明，（2.5 μg BHA＋2.5 μg 水提物）/mL 混合溶液的DPPH·自由基清除率大于2.5 μg/mL BHA 對DPPH·自由基的清除率，小于5 μg/mL BHA 對DPPH·自由基的清除率，但差異都不顯著。這一結果說明，在食品中添加BHA 時可用一部分藍莓葉水提物來代替，以減少人工合成抗氧化劑給人們健康帶來的危害。

表2 混合物對DPPH·自由基清除率的比較

2.4 藍莓葉水提物總抗氧化能力的測定

總抗氧化體系是檢驗抗氧化劑在食品體系中抗氧化作用的常用體系。本試驗將抗氧化劑配制成溶液，測定水提物、Vc 和BHA 的總抗氧化能力，其結果如圖5 所示。

從圖5 可以看出，在總抗氧化能力上，當質量濃度為40 μg/mL 時，BHA 的總抗氧化能力大于水提物，且差異達極顯著水平；當質量濃度為80，200 μg/mL 時，BHA 的總抗氧化能力也大于水提物，且差異顯著；但當質量濃度為120，160，240 μg/mL 時，水提物與BHA 的總抗氧化能力相近，二者差異不顯著。而Vc 的總抗氧化能力很強，當質量濃度為40 μg/mL 時，其總抗氧化能力就超過水提物與BHA 最大濃度時的總抗氧化能力。

3 結論與討論

本試驗通過對藍莓葉水提物的還原力、DPPH·自由基的清除能力和總抗氧化能力的測定，并以Vc 和BHA 為對照，來檢測水提物的抗氧化能力，同時考察了Vc 和BHA 對水提物抗氧化效果的影響。結果表明，藍莓葉水提物的還原力和DPPH·自由基的清除能力均低于Vc 和BHA，且差異達極顯著水平。但在還原力上，水提物與Vc 之間存在協同作用。因此，二者可同時使用。在DPPH·自由基清除能力上，可通過增加水提物的量，減少BHA 的量來達到相近的清除率。在總抗氧化能力上，雖然Vc 的活性很強，但BHA 和水提物差不多強弱，說明可以用藍莓葉水提物代替BHA，或者與BHA 混用，減少BHA的用量，減少其對人體健康的危害。因為在我國藍莓葉資源豐富，提取工藝簡便，藍莓葉水提物作為一種新型天然抗氧化劑應用前景廣闊。

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