植物硒轉運蛋白的研究進展

馬建輝，孫梅好

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004）

硒（selenium，Se）是哺乳動物、細菌等許多生物的必需微量元素[1-3]，適量補充硒有利于植物的生長發育，可提高農作物的產量及品質[4-8]。硒在土壤中的平均質量分數大約為0.4 mg/kg，某些地區的硒含量超過10 mg/kg[9]，可能會導致動物以及人類硒中毒[10-12]。人體內已發現25 種硒蛋白（selenoprotein），例如谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TrxR）、甲狀腺激素脫碘酶家族（thyroid hormone deiodinase families）等[13]。硒蛋白在生物體內有抗氧化、清除體內自由基的功能，硒的缺乏將會使癌癥、病毒感染以及男性不育的幾率增加[14-16]。硒的嚴重缺乏將會使動物患上白肌病，使人類患上克山病[17-18]。

農作物主要吸收轉化土壤中的硒酸鹽（selenate）和亞硒酸鹽（selenite），為人及哺乳動物提供硒。不同植物的硒累積量具有很大差異，有的甚至可達到1 000 倍[19]，這可能是不同植物的硒轉運蛋白的選擇性及轉運能力不同造成[20-21]。

在植物體內，硒酸鹽主要是通過硫酸鹽轉運蛋白進行吸收。而亞硒酸鹽的吸收比較復雜，有多種因素[22-27]可影響其在植物體內的累積。最近研究發現，多種膜轉運蛋白參與了亞硒酸鹽的吸收累積，如硅轉運蛋白[28]、磷酸鹽轉運蛋白[23，29]和單羧酸轉運蛋白[30]等。本文主要對近幾年植物硒轉運蛋白的研究結果進行總結，并對未來的研究方向進行展望。

1 植物對硒的吸收

硒是非金屬元素，有4 種同素異形體：灰色單質硒、紅色單質硒、黑色單質硒和無定形硒，其中，黑色單質硒最為穩定。在自然界中，硒主要以-2，0，＋4，＋6 等不同價態存在于有機和無機化合物中，其中，無機硒化合物主要是硒酸鹽和亞硒酸鹽，而有機硒形態較多，但參與蛋白質合成的主要是硒代半胱氨酸（selenocysteine，SeCys）和硒代甲硫氨酸（selenomethionine，SeMet）。

1.1 硒酸鹽和亞硒酸鹽在環境中的分布

在不同土壤條件下，硒酸鹽和亞硒酸鹽的分布不同。在氧氣比較充足、土壤比較干燥的堿性環境（（pe＋pH）＞15）中，硒酸鹽的含量較多；在潮濕、缺氧的酸性到中性土壤（7.5＜（pe＋pH）＜15）中，亞硒酸鹽的含量較多；在其他還原性較強的土壤（（pe＋pH）＜7.5）中，硒化物（selenide）占主要地位[26，31]。植物吸收少量的有機硒化物[32]，主要是通過不同的吸收機制吸收土壤中的硒酸鹽和亞硒酸鹽。

1.2 硒酸鹽轉運蛋白

硒和硫是同一主族元素，硒酸鹽和硫酸鹽物理化學性質相似[33]，高濃度硫酸鹽在一定程度上抑制硒酸鹽的吸收[34]，硫酸鹽轉運蛋白的突變可影響細胞對硒酸鹽的耐受能力[35-36]，表明硒酸鹽可通過硫酸鹽轉運蛋白進入細胞內。

根據硫酸鹽轉運蛋白編碼序列的同源性、動力學特性及組織和細胞定位的不同，硫酸鹽轉運蛋白可分為5 大類[37]。第I 類是高親和性的硫酸鹽轉運蛋白（硫酸鹽Km為1.5～10 μmol/L），如在擬南芥根部大量表達的AtSultr1；2 和AtSultr1；1[38]，通常在韌皮部表達的AtSultr1；3[39]。第II類大部分是低親和性的硫酸鹽轉運蛋白（硫酸鹽Km值大于100 μmol/L），如在根、葉微管組織中表達較多的AtSultr2；1，根韌皮部及葉維管束鞘細胞表達的AtSultr2；2[40-41]。第III 類在種皮、胚中表達，且其表達不受培養介質中硫酸鹽含量的影響[40]。第IV 類參與調節胞內硫酸鹽濃度[42]。推測第V 類可能參與液泡硫酸鹽的轉運[37]，但尚未得到證實。

第I 類硫酸鹽轉運蛋白對硫酸鹽的高親和性、在根系中大量表達以及受硫酸鹽的表達調控[37]，表明其在植物吸收硫酸鹽的過程中具有重要作用。為研究此類轉運蛋白是否也在硒酸鹽吸收過程中發揮同樣的功能，利用不同的擬南芥耐硒突變體sel1-11，sel1-12，sel1-13，sel1-14 發現第I 類硫酸鹽轉運蛋白AtSultr1；2 編碼區的突變或者啟動子突變均可提高其耐硒能力[36，43-44]。

AtSultr1；1 與AtSultr1；2 在吸收硫酸鹽過程中具有相同的功能，但AtSultr1；2 突變影響硒酸鹽吸收能力，而AtSultr1；1 突變不影響其吸收[36]，說明AtSultr1；2 為硒酸鹽轉運蛋白。紫云英屬高累積硒植物，莖部的硒含量可達干質量的0.6%，比非累積植物高100～1 000 倍[19]，這可能是由于不同植物的硒酸鹽轉運蛋白的選擇性及轉運能力不同造成的[20]。

1.3 亞硒酸鹽轉運蛋白

亞硒酸為弱酸，其pKa1和pKa2分別為2.57和6.60[28]。亞硒酸鹽在pH 值低于2.5 的環境中主要為H2SeO3/SeO2；在pH 值為2.5～6.6 的環境中主要為HSeO3-，在pH 值大于6.6 的環境中主要為SeO32-[28]。因其解離狀況的不同，植物根系細胞對不同形態的+4 價態硒化合物的吸收能力可能不同。研究表明，水稻幼苗根在不同pH 值條件下對亞硒酸鹽可能具有不同的吸收機制[26]。結果顯示，pH 值為3.0，8.0 時，DNP 和低溫（4 ℃）對水稻根系吸收硒的能力僅有較小程度抑制；而pH 值為5.0 時，DNP 和低溫能夠抑制大部分亞硒酸鹽的吸收。進一步分析表明，在pH 值為3.0的條件下，亞硒酸鹽可能主要是通過水孔蛋白被動進入根細胞；而在pH 值為5.0 的條件下，主要以主動方式進入根細胞[26]。

最近，Zhao 等[28]發現，屬于水孔蛋白家族的水稻硅轉運蛋白Lsi1（OsNIP2；1）可作為亞硒酸鹽轉運蛋白發揮功能（圖1）。lsi1 水稻突變株與野生株相比，地上部分和木質部汁液中硒濃度明顯降低，而硫酸鹽的吸收不受影響；lsi2 突變株與野生株相比，亞硒酸鹽的吸收能力幾乎不受影響，表明水稻硅轉運蛋白Lsi1 參與了亞硒酸鹽的吸收，而Lsi2 沒有參與此過程[28]。為了明確Lsi1對亞硒酸鹽的運轉活性，Zhao 等[28]在酵母中表達lsi1 時發現，在偏酸性（pH 值為3.5，5.5）條件下，Lsi1 可促進亞硒酸鹽的吸收；而在偏堿性（pH 值為7.5）條件下，Lsi1 對亞硒酸鹽的吸收能力沒有明顯變化。這可能是由于pH 值影響了亞硒酸鹽的解離[28]，在偏酸性條件下，主要是不帶電荷的H2SeO3/SeO2可通過水孔蛋白進出細胞。

目前，尚沒有在植物中發現HSeO3-轉運蛋白。因為HSeO3-與單羧酸結構類似，McDermott 等[30]認為，亞硒酸鹽可通過單羧酸轉運蛋白Jen1p 進行吸收，且溶液pH 值會影響其轉運活性，在pH值為4.5～7.5 范圍內，隨著pH 值降低，轉運活性會提高；且質子梯度解偶聯劑極大地抑制其轉運活性[30]，說明此轉運過程為質子梯度推動的或者是ATP 依賴的主動轉運過程。此結果與氰化物抑制單羧酸轉運蛋白活性，抑制細胞對乳酸、丙酮酸等的吸收[45-46]，以及解偶聯劑和低溫抑制水稻根細胞在pH 值為5.0 時對亞硒酸的吸收[26]是一致的。Lazard 等[29]發現，酵母磷酸鹽轉運蛋白在pH 值為6.0 時具有亞硒酸鹽轉運活性。磷酸的Ka1，Ka2，Ka3分別為7.25×10-3，6.31×10-8和3.98×10-13，在pH 值為6.0 時磷酸鹽主要形態為H2PO4-，而亞硒酸鹽主要形態為HSeO3-。我們推測因HSeO3-與H2PO4-結構類似，導致在此pH 值條件下，亞硒酸鹽可通過磷酸鹽轉運蛋白進行轉運。Li 等[23]也發現，植物磷酸鹽轉運蛋白參與了亞硒酸鹽的吸收。

在偏堿性條件下，亞硒酸鹽的主要形式為SeO32-[28]，水稻的亞硒酸鹽吸收量較酸性條件下吸收量少很多[26，28]，導致此現象的原因可能為植物對SeO32-吸收能力低或者在此條件下外排亞硒酸鹽能力提高。酵母亞硒酸鹽外排蛋白SSU1在酵母的耐硒過程中[47]具有重要的功能。植物體內是否具有同樣功能的蛋白尚沒有報道。

亞硒酸鹽吸收途徑的多樣性導致植物對亞硒酸鹽的吸收量受到多種因素的影響，如呼吸抑制劑、代謝抑制劑、硝酸鹽、磷素營養、pH 值及谷胱甘肽均可影響植物對亞硒酸鹽的吸收[22-27]。由圖1 可知，我們推測硒的跨膜轉運是由多種轉運蛋白參與的，除硒酸鹽轉運主要通過硫酸鹽轉運蛋白進行外，亞硒酸鹽基于其在不同酸堿度情況下的解離形式，推測分別利用水孔蛋白類通道轉運H2SeO3/SeO2，酵母磷酸鹽和單羧酸轉運蛋白轉運HSeO3-，植物體內是否存在SeO32-轉運蛋白以及亞硒酸鹽外排蛋白尚不清楚。

目前，大部分硒的吸收轉運研究主要集中在植株水平上，為進一步分析不同轉運蛋白吸收硒能力的差異，建立硒酸鹽及亞硒酸鹽轉運蛋白的標準鑒定方法，進而分析不同轉運蛋白的硒通透能力、親和能力的差異，以及利用結構生物學手段分析其結構差異，為深入探討不同植物耐硒能力差異的機理奠定基礎。

2 硒在植物體內的同化代謝

植物從根部轉運硒至地上部的轉運效率取決于根從土壤中吸收硒的類型，硒酸鹽被根系吸收后，可被運輸到地上部分[23，25]，在葉綠體內進行硒酸鹽同化（圖2）。而植物吸收的大部分亞硒酸鹽累積于根部[25]，木質部的亞硒酸鹽含量很低[23，25]。這可能是由于亞硒酸鹽在根部很快被轉化為其他形式的硒化合物，如硒代甲硫氨酸（SeMet）和硒代甲硫氨酸水合物（selenomethionine Se-oxide hydrate，SeOMet）等，但大多數為非水溶性硒化合物[22-23]。

硒在植物體內的同化代謝過程已經被研究得較為清楚[21，48]（圖2），硒酸鹽進入葉綠體后在ATP 硫酸化酶1（ATP sulfurylase 1，ATPS1）的催化下合成腺苷-5′-磷酰硒酸（Adenosine 5′-phosphoselenate，APSe）[49]，APSe 可被APS 還原酶2（APS Reductase 2，APR2）還原形成亞硒酸鹽[50-51]或者經GSH 的還原生成亞硒酸鹽并進一步還原成Se2-[48]，Se2-在半胱氨酸合成酶（Cys synthetase）的催化作用下合成SeCys。合成的SeCys 有多種代謝去路。SeCys 經半胱氨酸裂解酶（selenocysteine lyase，SL）裂解成Se0和丙氨酸；或者在胱硫醚-γ-合成酶（Cystathionine-γ-synthase）的催化下形成硒代胱硫醚（Secystathionine，SeCysth），后被胱硫醚-β-裂解酶（Cystathionine-β-lyase）裂解為硒代高半胱氨酸（Sehomocysteine，SeHo-Cys）；也有部分SeCys 進入胞液，在胞液中被SL裂解生成Se0，或者被硒代半胱氨酸甲基轉移酶（SeCys methyltransferase，SMT）甲基化形成甲基硒代半胱氨酸（MSeCys），MSeCys 在相關酶的作用下進一步甲基化形成具揮發性的二甲基二硒化物（DMDSe）[52-54]。另外一種形成揮發性硒化物的途徑為：葉綠體內的SeHoCys 進入胞液內形成硒代甲硫氨酸，硒代甲硫氨酸被甲硫氨酸甲基轉移酶（MMT）甲基化形成甲基甲硫氨酸（MSeMet），MSeMet 進一步甲基化形成揮發性二甲基硒化物（DMSe）。在葉綠體和胞液中的硒代半胱氨酸和硒代甲硫氨酸在一定條件下可取代半胱氨酸和甲硫氨酸參與蛋白質的合成，使蛋白不能正確折疊[55-56]，甚至阻止mRNA 的翻譯[57]，從而導致植物生長受到抑制[58]。

3 展望

硒是一種重要的生命元素，它不僅是動物、人類和微生物的必需元素[1-3]，也是植物生長發育的有益元素[4-8]。自然環境中硒主要以硒酸鹽和亞硒酸鹽2 種氧化形態存在，植物和微生物可以吸收環境中的硒酸鹽和亞硒酸鹽，將其轉化為有機硒被人類和動物所利用。

硒酸鹽在植物體內的同化代謝過程已較為清楚，普遍認為，植物吸收硒酸鹽主要是通過硫酸鹽轉運蛋白進行。利用突變體的研究結果表明，即使是同一類型的硫酸鹽轉運蛋白，其轉運硒酸鹽的能力也可能不同[36]。可借鑒離子通道的鑒定分析方法，建立硒酸鹽轉運蛋白的標準鑒定方法，為進一步分析不同硒轉運蛋白的轉運能力及特異性，比較同一物種不同的轉運蛋白以及不同物種轉運蛋白的轉運特異性及能力差異等奠定基礎。

某些植物水孔蛋白和磷酸鹽轉運蛋白參與了亞硒酸鹽的吸收[23，26，59]，植物的單羧酸轉運蛋白是否也具有亞硒酸鹽吸收轉運活性尚不清楚。根據目前的結果，我們推測亞硒酸鹽的吸收轉運途徑為3 種對應于H2SeO3/SeO2，HSeO3-和SeO32-的轉運蛋白和一種外運途徑。這種亞硒酸鹽吸收途徑的多樣性，可能是影響細胞代謝、亞硒酸鹽形態等多種因素[22-27]以及亞硒酸鹽吸收量的原因。建立亞硒酸鹽轉運的標準鑒定方法，為進一步分析鑒定不同形態亞硒酸鹽的吸收轉運載體及其特性、鑒定植物體內的候選硒酸鹽外排蛋白等工作提供條件。

綜上所述，為深入研究分析植物硒轉運蛋白，亟待解決的問題包括：（1）建立鑒定硒轉運蛋白標準方法；（2）分析不同轉運蛋白的特性（Km，Vm，特異性等）；（3）克隆分析植物磷酸鹽轉運蛋白和單羧酸轉運蛋白等的硒轉運特性；（4）比較硒累積能力具有很大差異的植物同源硒轉運蛋白的轉運能力差異；（5）明確植物是否外排硒轉運蛋白等。這些問題的闡明將有助于我們深入探討植物的富硒、耐硒原理，為進一步通過培育富硒糧食作物滿足人類對硒的需求，培育耐硒植物進行高硒環境的生物修復等奠定基礎。

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