基于接枝二茂鐵介體的BOD 微生物傳感器

胡 磊,李 軼

(1.河海大學淺水湖泊綜合治理與資源開發教育部重點實驗室, 江蘇南京 210098;2.河海大學環境學院, 江蘇南京 210098)

生化需氧量(BOD)作為重要的衡量水與廢水中有機污染程度的指標,在水污染控制中具有非常重要的作用。傳統經典的BOD 測量方法需要5 d 時間,而且操作復雜、受外界影響大,不能滿足對污染水體或污染源在線監測的要求[1]。自Karube 等[2]于1977 年最先研制出用于測量BOD 的微生物傳感器后,國內外很多學者研發出各種基于不同菌種及混合菌種的BOD 傳感器[3-6]。現有的基于微生物傳感器的快速測定方法將測量時間從5 d 縮短到30 min,極大地滿足了對水和廢水BOD 監測的要求,但是也存在著對水樣中DO 依賴大等問題。

近年來,越來越多的學者[7-9]研究利用氧化還原介體代替分子氧作為監測微生物分解代謝的最終電子受體。在微生物的生化反應中氧化態的介體失去電子,轉變為還原態的介體,此過程的電子變化產生傳感器電流響應,從而可以定量反應中氧化還原物質的量。很多利用介體促進微生物生化反應的研究,反應體系是水溶液,且介體的濃度很高,如達40 mmol/L[10]和55 mmol/L[11],導致介體的浪費。筆者針對以上問題,開發出基于接枝二茂鐵介體的微生物傳感器,將介體接枝到大分子材料中,并包埋于聚乙烯醇(PVA)中,保持了介體的性能并避免了介體的流失,很好地應用于測量廢水中的BOD。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

二茂鐵(Fc),KH550 (3-aminopropyltriethoxysilane,3-APTES), 聚乙烯醇(PVA, 醇解度90%, 分子量22 000)購自南京曙光化學有限公司,其余試劑均采用分析純試劑。磷酸鹽緩沖溶液(PBS, pH =7.2)(由36 mL 的71.64 g Na2HPO412H2O 和14 mL 的31.21 g NaH2PO42H2O 混合配制而成)。BOD 標準校正溶液(GGA)[12],采用葡萄糖(150 mg/L)、谷氨酸(150 mg/L)混合溶液。

1.2 二茂鐵介體的接枝

將Fc與微生物固定化于PVA 包埋材料中,在微生物對有機物的降解反應中代替氧為最終的電子受體。由于Fc 是小分子有機物,其分子的大小(nm 級)遠遠小于包埋材料的孔徑(平均為μm 級),故需要與大分子有機物進行接枝。SBA-15 是一種具有巨大比表面積的介孔氧化硅材料,其豐富的表面羥基為接枝創造了良好的條件,其制備過程見文獻[13] ,二茂鐵甲酸的制備見文獻[14] 。將6.9 g 二茂鐵甲酸和6.63g KH550 溶解在50mL 氯仿和50mL N,N-二甲基甲酰胺的混合溶劑中,加入4.67 g 1-羥基苯并三唑,當上述溶液冷卻到0 ℃時,加入6.68 g EDCI(1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)-propyl] carbodiimide hydrochloride)和3.6 g NMM(N-methylmorpholine)。將溶液從冰浴中取出,常溫攪拌24 h,加入8 g SBA-15并繼續攪拌48 h。過濾所得的混懸液,濾渣在索氏提取器中用氯仿過夜洗滌除去游離的成分,所得的固體真空干燥, 得到14.2 g 樣品, 樣品被標記為Fc-SBA-15。Fc-SBA-15 的合成步驟見圖1。

1.3 微生物培養及固定化

圖1 Fc-SBA-15 合成示意圖

微生物選用從活性污泥(取自江心洲污水處理廠)分離出的混合菌種。將取來的活性污泥經雙層紗布過濾后,在濾液(混合菌種)中投加好氧菌培養基,包含0.1%蛋白胨,0.1%牛肉膏及0.1%CaCl2。在30 ℃水浴中曝氣培養24 h,菌液在550 nm 波長處的吸光度達到0.8 時,將菌液以7 200 r/min 離心5 min,離心后用pH 為7.2 的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,清洗后的菌液再次離心。重復此過程兩遍后,將離心后的菌泥與Fc-SBA-15 介體懸濁液、10%的PVA 溶膠進行混合包埋,混合均勻后壓制成片(厚度為0.3μm),室溫晾干后裁剪成適合的大小,作為傳感器的生物敏感材料。

1.4 傳感器系統的構建

利用三電極系統作為電化學的換能器。分別用玻碳電極(截面直徑6mm)為工作電極,Pt 電極為對電極,飽和甘汞電極為參比電極,以通路的電流值為測量指標。玻碳電極在使用前分別用1.0 μm、0.3μm和0.05 μm α-Al2O3打磨至光滑,每次打磨后均用去離子水仔細清洗。最后打磨好的玻碳電極在室溫下晾干。和以前相關的研究[15]相比,本研究使用了更少的Fc 介體,并有效地阻止介體從包埋材料中流失。

2 結果和討論

2.1 接枝Fc 樣品的表征

分析Fc-SBA-15 和SBA-15 樣品的紅外光譜(圖2),SBA-15 在3 750 cm-1處有清晰的振動譜帶,此振動吸收為硅羥基吸收峰,Fc-SBA-15 在波數3 750 cm-1處此振動譜帶明顯退化,顯示硅羥基被反應消耗。Fc-SBA-15在波數3 100 ～2 800 cm-1和1 550 ～1 250 cm-1處有明顯的振動,此振動帶歸屬于N—H和C—H 鍵[11],因為純SBA-15 在此區域沒有振動,而KH550 中含有N—H 和C—H 鍵,說明KH550 的骨架存在于Fc-SBA-15 中。另外,1 700 ～1 500 cm-1處的振動歸屬于酰胺基團,酰胺基團是KH550 的氨基與二茂鐵甲酸的羧基縮合的結果,由此證明了Fc已被成功接枝到了SBA-15 上。

圖2 Fc-SBA-15 和SBA-15 的紅外譜圖

由圖3 可知,電極插入于0.01M 的PBS 溶液中,電位的掃描速度為50 mV/s,固定了Fc-SBA-15 的介體具有明顯的氧化還原峰,而對照樣SBA-15 則沒有氧化還原峰,證明了在電化學反應中起電子傳遞作用的物質是Fc。

圖3 介體的循環伏安

2.2 傳感器的性能

在實驗優化的條件下,用BOD5為50 m/L 的GGA標準溶液對傳感器進行測試。結果表明,傳感器的質量濃度線性范圍為2 ～300 mg/L,單個傳感器連續測量20 個標準樣品的精密度為4.2%,傳感器能連續穩定工作35 d(傳感器響應電流衰減在15%以下)。

2.3 pH、溫度和重金屬離子的影響

溶液中的pH 值影響著微生物的生理狀態。考察在一定的營養條件(ρ(BOD5)=100 mg/L,pH 為6～9)下傳感器固定化微生物的活性。實驗表明,傳感器響應電流差ΔΙ隨著pH 值的增加而逐漸增大,響應電流差ΔΙ在pH 值為7.2 時最大,然后逐漸下降。因此pH 值為7.2 時是最佳條件,具體見圖4。

圖4 pH 對傳感器的影響

溫度是影響微生物生理代謝的重要因素,適宜的溫度能提高微生物的生理活性。在ρ(BOD5)=100mg/L,溫度為20 ～40 ℃的營養條件下,考察了傳感器的響應電流差。結果表明,隨著溫度的上升,傳感器的響應電流差逐漸增大,溫度達到30 ℃時響應值最高,隨后響應值緩慢下降。結果表明溫度為30 ℃時為系統微生物的最適宜溫度,詳見圖5。

圖5 溫度對傳感器的影響

生活污水和工業廢水中會含有多種重金屬。常見的重金屬離子有Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+、Cd2+等。適量的重金屬對微生物的生理影響不大,過量的重金屬對微生物會產生抑制作用,降低微生物的生理活性,使微生物從分解代謝為主轉為內源代謝為主,從而降低了傳感器的響應電流值。筆者研究了Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+、Cd2+這5 種重金屬離子對傳感器的影響。結果表明, 在重金屬濃度低于100 mmol/L 時,重金屬對傳感器響應無影響(抑制率小于5%)。重金屬濃度大于500 mmol/L 時,對傳感器的微生物有明顯的抑制作用(抑制率大于15%)。5種重金屬離子的抑制率由大到小順序為：Pb2+、Cd2+、Cu2+、Cr3+、Zn2+。

2.4 實際廢水監測

對污染河道河水,污水處理廠(江心洲污水處理廠)進水、出水及食品工業廢水分別進行BOD 傳感器快速測量,并與BOD5相對照(表1)。結果均表明Fc傳感器法測得的BOD 值(BODs)與標準的五日法測定的值具有良好的可比性。相比而言,低濃度的河水水樣和污水處理廠出水的相關度略差。可能是因為河水和污水處理廠出水中難生物降解的大分子有機物相對較多,微生物短時間難以降解。

表1 實際廢水監測結果

3 結 論

a.與大分子材料SBA-15 接枝處理而得的介體Fc-SBA-15,在保持了電化學活性的同時,也阻止了介體從包埋材料中流失。

b.實驗得出傳感器的最優化工作條件為pH 7.2,溫度30 ℃。廢水中常見的Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+、Cd2+重金屬離子在100 mmol/L 濃度下對傳感器無影響。

c.傳感器的線性范圍為2 ～300mg/L,連續測量20 個樣品的精密度為4.2%,能連續工作35 d,在線性范圍內對低、中、高濃度實際廢水測得的BOD 值,與BOD5均具有較好的相關度。

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