豬流行性腹瀉病毒SZ株的分離與鑒定

郝偉偉 邱文英 徐 靜 方鵬飛 向丕元 張麗燕 胥燕芳

（四川省華派生物制藥有限公司 四川簡陽 621400）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diahorrea Virus，PEDV）是引起豬嘔吐、腹瀉和脫水為主要臨床癥狀特征的豬腸道傳染病病原，哺乳仔豬、架子豬或育肥豬等各年齡段均可發(fā)病，但哺乳仔豬發(fā)病和死亡最為嚴重［1-3］。該病多發(fā)生在冬春寒冷季節(jié)，我國以12月至次年2月為高發(fā)季節(jié)。豬流行性腹瀉于1971年首次在英國報道［4］，比利時、英國、德國、法國、荷蘭、瑞士、保加利亞和中國臺灣等國家和地區(qū)都有發(fā)生［5］。中國從1976年開始有流行性腹瀉的報道，20世紀(jì)80年代后該病在中國流行面逐漸擴大［6］。流行性腹瀉病毒常與豬傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒等其他腸道病原混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失。

1 材料與方法

1.1 材料1.1.1 病料 來自資陽某豬場發(fā)生腹瀉、嘔吐、死亡仔豬的糞便。

1.1.2 生化試劑 TRIzol Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品；RNA PCR Kit、Mix、D2000 DNA Marker、膠回收試劑盒購自TaKaRa公司；瓊脂糖購自GIBCO公司。

1.1.3 細胞及培養(yǎng)試劑 綠猴腎細胞（Vero），購自中國獸藥檢查所；DMEM營養(yǎng)液、胰蛋白酶購自GIBCO公司；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗血清，購自康為世紀(jì)。

1.1.4 病毒鑒定引物 根據(jù)GeneBank報道的PEDV S基因cDNA序列（登陸號DQ072726），設(shè)計1 對引物，P1：5′-TCGTTTTGGGTGGTTACCAC-3′；P2：5′-AGTGGCAAATACATTGGC AGCG-3′。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 取檢糞樣用PBS以1：10的重量體積比進行稀釋后，研碎混合均勻，反復(fù)凍融3次。該混合物于4℃ 4000 r/min離心15 min，取上清液于0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液分裝，-70℃保存。

1.2.2 RT-PCR檢測 采用Trizol法提取待檢樣品中的病毒RNA，使用引物P2及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA擴增，擴增條件：42℃反應(yīng)50 min，72℃滅活10 min。以cDNA為模板，引物P1、P2進行PCR擴增，循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，53℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行電泳檢測。

1.2.3 病毒分離 按常規(guī)方法制備Vero細胞，培養(yǎng)24 h至單層，按5%接種檢測陽性的病毒液，并添加胰酶至終濃度50 μg/mL，37℃吸附1 h，其間輕搖2次。待吸附結(jié)束后，加入含有終濃度50 μg/mL胰酶和含2%血清DMEM溶液作為維持液，37℃培養(yǎng)，72 h作為一個傳代周期。傳代前，將上一次的細胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，按上述方法進行盲傳。

1.2.4 病毒鑒定

1.2.4.1 病毒的免疫熒光檢測 將分離毒株的病毒液1.0 mL接種已長成單層的Vero細胞上，48 h后（同時設(shè)立不接毒的Vero細胞為陰性對照），棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次。加入1000 μL丙酮置于4℃固定15 min。棄去固定液，敞開培養(yǎng)瓶自然干燥。將細胞單層用PBS沖洗3次，然后將細胞單層用5%脫脂乳封閉30 min，之后倒去脫脂乳，加入稀釋的兔抗PEDV陽性血清（1：100），滴加細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入37℃溫箱內(nèi)作用1 h；用PBS洗滌3次，再加入稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗血清（1：200），滴加細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入37℃溫箱內(nèi)作用1 h；然后用PBS沖洗3次，避光干燥，放到熒光顯微鏡上觀察各種細胞中的熒光強弱。

1.2.4.2 S基因部分序列測定 采用Trizol法提取待細胞培養(yǎng)物的病毒RNA，以P1、P2為引物進行RT-PCR方法擴增M基因片段，進行電泳，切下目的片段進行膠回收?；厥盏降腄NA片段送至英濰捷基生物公司進行基因測序。將測序結(jié)果與GeneBank報道的PEDV S基因cDNA序列進行比對。

1.2.5 動物回歸試驗 將培養(yǎng)的流行性腹瀉病毒液稀釋至病毒含量為105.0TCID50/mL，口服接種豬流行性腹瀉病毒血清學(xué)陰性的3～5日齡仔豬，1.0 mL/頭，設(shè)DMEM細胞培養(yǎng)基的仔豬3頭作為對照，試驗組和對照組隔離飼養(yǎng)，接種后觀察7 d。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測結(jié)果 以P1、P2為引物，用RTPCR方法檢測待檢樣品，電泳結(jié)果見圖1。1號樣品有特異性條帶，約600 bp，呈陽性，2、3號樣品及空白對照無條帶。

圖1 RT-PCR檢測樣品中的PEDV

2.2 病毒分離結(jié)果 病毒盲傳至第3代時，于細胞接種第3 d出現(xiàn)細胞病變（CPE），傳至第6代時于36 h后出現(xiàn)CPE，CPE表現(xiàn)為細胞折光度降低、圓縮、顆粒變性、融合，進而脫落。繼續(xù)傳10代，出現(xiàn)CPE時間穩(wěn)定，第10代收獲培養(yǎng)物，病毒含量達106.5TCID50/mL。

2.3 病毒鑒定

2.3.1 病毒的間接免疫熒光檢測結(jié)果 使用兔抗PEDV陽性血清，PEDV接種Vero細胞40 h后，在胞中檢測到病毒的抗原，可見強烈的熒光。而在PEDV未感染的Vero細胞中，并未見任何綠色熒光，說明PEDV在Vero細胞中復(fù)制增殖。

2.3.2 S基因序列擴增結(jié)果 以P1、P2為引物擴增細胞培養(yǎng)物S基因，電泳結(jié)果見圖2。使用TaKaRa公司的膠回收試劑盒回收目的片段，電泳檢測結(jié)果見圖3，條帶單一明亮，送樣測序。

圖2 部分S基因的擴增

圖3 膠回收結(jié)果

測序結(jié)果為所擴增DNA長度為592 bp（見圖4）；編碼 197個氨基酸（見圖5）。

將所擴增部分S基因序列與Genebank上登錄的其他流行性腹瀉病毒株的S基因相比較，使用MEGA4.0建立系統(tǒng)進化樹，見圖6。結(jié)果表明PCR擴增的部分S基因與CH/XJUrumqi/2011的S1基因同源性最高，為98.3%，氨基酸同源性97.97%；與AF500215 S1（Korean）基因同源性和氨基酸同源性分別為93.25%和89.34%。與日本株KH及中國LZC株同源性要低一些。

2.4 動物回歸試驗 豬流行性腹瀉病毒接種3～5日齡仔豬24 h后，仔豬陸續(xù)出現(xiàn)典型的嘔吐、腹瀉癥狀，3 d后出現(xiàn)死亡。剖檢死豬發(fā)現(xiàn)，小腸擴張，內(nèi)充滿黃色液體，腸系膜充血，小腸絨毛縮短。采集發(fā)病仔豬的糞便進行RT-PCR檢測，證明含有PEDV。對照組仔豬未出現(xiàn)感染癥狀。

3 結(jié)論與討論

圖4 擴增的DNA序列

圖5 編碼蛋白質(zhì)的序列

圖6 PEDV分離株S基因進化樹分析

試驗首先使用RT-PCR方法確定疑似發(fā)生豬流行性腹瀉豬場仔豬的糞便樣品中含有豬流行性腹瀉病毒，再使用Vero細胞進行盲傳。同時以RTPCR法擴增S基因的部分片段并測序，進行序列分析并結(jié)合免疫熒光檢測及回歸試驗，證明分離得到一株豬流行性腹瀉強毒株，命名為SZ株。

病毒分離的主要目的是通過對病毒的檢測和純化，獲得純化的病毒粒子，并將其進行傳代培養(yǎng)。自20世紀(jì)70年代初發(fā)現(xiàn)以來，曾用各種方法試圖把病毒適應(yīng)于細胞培養(yǎng)，但是一直沒有獲得成功，成為病毒學(xué)上的一道難題。直到1988年瑞典Hoffman等首次在Vero傳代細胞的培養(yǎng)液中加入胰酶，病毒培養(yǎng)獲得成功，連續(xù)傳5代出現(xiàn)細胞病變［7］。本次研究中也在培養(yǎng)液中加入50 μg/mL胰酶，以保證病毒生長繁殖。

傳統(tǒng)方法鑒別診斷PEDV主要從病毒的抗原檢測、病毒的電鏡檢測、病毒的分離與鑒定、血清學(xué)診斷等方面進行，這些方法都需要在檢測前對病料進行一系列大量而煩瑣的前期處理，耗時長。RT-PCR技術(shù)相對于傳統(tǒng)方法而言，簡便、快速且特異性高，能夠用于疾病的早期檢驗［8-9］。

從2010年春季至今，我國的很多省份，以及泰國、菲律賓、韓國等亞洲國家的規(guī)模化豬場暴發(fā)嚴重的豬流行性腹瀉疫情，病毒變異是豬流行性腹瀉暴發(fā)的主要原因。2010年后我國國內(nèi)的田間野毒株與經(jīng)典毒株的遺傳距離很大，導(dǎo)致傳統(tǒng)的疫苗無法對豬群產(chǎn)生完全的免疫保護。有研究表明PEDV的變異主要集中在S基因上［10］，S基因編碼S蛋白，在免疫反應(yīng)中有識別靶細胞，使病毒和細胞膜融合的作用［11］。研究PEDV的S基因及S蛋白，比較不同病毒株的親緣關(guān)系，對疫苗的研制及使用具有重要的意義。

［1］ 毛雅元，張桂紅，葛俊偉，等.豬流行性腹瀉病毒地方株LJB/03 分離及培養(yǎng)特性［J］. 病毒學(xué)報，2010，26（6）：483-489.

［2］ 錢永清，聞人楚，唐永蘭，等.豬流行性腹瀉病毒的分離培養(yǎng)鑒定［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，1999，15（2）：41-44.

［3］ 倪艷秀，林繼煌，何孔旺，等.豬流行性腹瀉研究概況［J］.畜牧與獸醫(yī)，2001，33（1）：38-39.

［4］ Pensaert M B，Debouck P.A New Coronavirus-like Particle Associated with Diarrhea in Swine ［J］.Arch Virol，1978，58（3）：243-247.

［5］ 張桂紅.豬流行性腹瀉病毒地方株LJB/03分離鑒定［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［6］ 王龍濤，葛晨霞，王翠瑜，等.豬傳染性胃腸炎病毒吉林株的分離鑒定及S基因的克隆與序列分析［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2010，30（10）：1277-1281.

［7］ Hofmann M，Wyler R.Propagation of the virus of Procine Epidemic Diarrhea in cell culture ［J］.J Clin Microbiol，1988，11：2235-2239.

［8］ Kinm O，Choi C，Kim B，et al.Detection and differentiation of porcine diarrhoea virus and transmissible gatroenteritis virus in clinical samples by mutiplex RT-PCR［J］.Vet Rec，2000，146（22）：637-640.

［9］ 田小艷，孫華，鄧雨修，等.3種致豬腹瀉病毒的多重RT-PCR 檢測［J］.動物醫(yī)學(xué)展，2009，30（9）：54-57.

［10］ 劉孝珍，陳建飛，時洪艷，等.2011年豬流行性腹瀉病毒的遺傳變異分析［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2012，34（3）：180-183.

［11］ 劉鄧，冉多良，袁秀芳，等.豬流行性腹瀉病毒CH/ZJ分離株S基因的克隆、原核表達和免疫原性分析［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010（2）：19-23.