杜洛克豬腸毒素大腸桿菌F4ac MUC13基因型與生長性能的關聯性分析

阮國榮 肖石軍 劉亞軒 陳福珍 林國忠 孫耀華

（1.福建農業職業技術學院 福州 350119；2.江西農業大學省部共建生物技術國家重點試驗室培育基地南昌 330045；3.福建光華百斯特生態農牧有限公司 福建三明 365100；4.廈門國壽種豬開發有限公司 福建廈門 361000）

斷乳前仔豬腹瀉是養豬生產中的常見疾病，給世界養豬業造成了巨大的經濟損失。據保守估計，我國每年至少有1000萬頭斷乳前仔豬腹瀉致死病例。而產腸毒素大腸桿菌F4（ETEC F4）是引發新生和斷乳前仔豬腹瀉的最主要致病菌，ETEC F4的致病性取決于其是否能與豬小腸上皮細胞表面刷狀緣的受體特異性結合，無受體豬表現為抵抗型，有受體豬則表現為易感型。ETEC F4有3種血清型：F4ab，F4ac和F4ad，而F4ac在西方豬群中是最主要的致病菌［1-2］。因而，抗腹瀉育種的關鍵是檢測ETEC F4ac受體基因。F4ac受體基因的定位和鑒別得到了國內外多個研究小組的重視，江西農業大學動物生物技術國家重點試驗室培育基地自2002年以來，通過全基因組連鎖定位分析、目的區域的斷點重組分析和遠緣群體的高通量SNPs標記關聯性分析等遺傳研究手段，確定了MUC13為決定斷乳前仔豬腹瀉易感性的ETEC F4ac受體基因［3］。

然而，隨著斷乳仔豬抗腹瀉分子研究的深入及抗腹瀉分子育種技術的推廣，仔豬抗腹瀉基因純合的同時，其生長性能是否受到影響，也即MUC13抗性純合基因型與生長性能是否具有負相關性，已是廣大育種場家較為關注的問題。為此，本小組于2010-2012年在福建光華百斯特生態農牧有限公司和廈門國壽種豬開發有限公司兩家國家級核心育種場進行了杜洛克MUC13基因檢測和生長性能測定對比試驗，以期探尋杜洛克豬ETEC F4ac MUC13基因型與生長性能的關聯性。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 試驗動物來自福建光華百斯特生態農牧發展有限公司、廈門國壽種豬開發有限公司2家國家級核心育種場的杜洛克核心群后代仔豬，樣本總數525頭。

1.2 基因檢測

1.2.1 樣本采集 對525頭杜洛克后代仔豬采樣，方法是將待檢測豬的耳尖用酒精消毒后，用耳號鉗剪取耳組織樣品2～3 g，放入盛有75%酒精的1.5 mL Eppendorf管內，低溫保存。采用常規的苯酚/氯仿/異戊醇法提取基因組DNA，統一稀釋至20 ng/L。

1.2.2 基因型判定 PCR引物由上海生工生物有限公司合成。主效基因位點的引物序列及其判型方法見表1。PCR反應體系總體積為20 μL，包括模板DNA 40 ng，10 × buffer 2.0 μL，25 mM MgCl21.2 μL，10 mM dNTP 0.3 μL，Fp 0.4 μL，Rp 0.4 μL，Taq 聚合酶 0.5 μL，超純水 13.2 μL。PCR 循環參數：94 ℃變性 3 min，94 ℃ 30 s，退火溫度（見表1）30 s，72 ℃延伸45 s，共36個循環。

采用PCR-SNaPshot判定MUC13基因型，反應體系為 5 μL，包含 1.5 μL 純化后 PCR 產物，2 μL SNaPshot multiplexmix（含Taq聚合酶和熒光標記的 dd-NTPs），1.2 μL 去離子水，0.3 μLSNaPshot引物。SNaPshot反應體系的擴增程序為：96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 30 s，25個循環。然后，在SNaPshot反應產物中加0.57 μL 1×NEB buffer和0.1 μL的CIP純化酶，37℃反應60 min以清除熒光標記的ddNTPs，隨后75℃反應15 min滅活純化酶。最后，每 1 μL SNaPshot 反 應 產 物 加 8 μL Hi-Di formamide與 GeneScan 120 LIZ size standard混合物（兩者比例為20：1），經變性后上樣于ABI 3130XL遺傳分析儀（ABI，USA）進行電泳，利用GeneMapper Software version 4.0（ABI，USA）進行基因型判定和數據收集。

表1 PCR引物及其判型方法

1.3 生長性能測定 將所有經采樣進行基因檢測的杜洛克仔豬選留，按農業部頒布的《種豬性能測定規程》標準（NY/T 822-2004）進行生長性能測定，測定指標包括生長速度和活體背膘厚。將豬只飼養至85～105 kg時進行稱重、同時利用ALOKA 500 B超儀進行活體背膘測量，所測數據錄入GBS育種軟件，校正到達100 kg體重時的日齡和背膘厚。

2 結果與分析

2.1 MUC13基因的基因頻率和基因型頻率 所檢測525頭杜洛克仔豬的MUC13基因型頻率及基因頻率的分布見表2。

表2 MUC13基因的基因型頻率和基因頻率

2.2 生長性能測定結果 所有豬只生長測定實際結果及經GPS軟件運行校正達100 kg體重日齡與背膘厚結果如表3。經SPSS統計分析，各基因型組間達100 kg體重日齡和背膘厚差異均不顯著（P＞0.05）。

3 討論

1）根據對525頭杜洛克仔豬的MUC13基因型檢測分析可見，在目前兩場的杜洛克種豬群中，仔豬斷乳前腹瀉抗性基因頻率高達0.9以上，純合抗性基因型頻率也達0.832，這與MUC13在福建主要商業豬種［4］及全國引進商業豬種［5］表現基本一致。目前杜洛克生產群的生長性能表現實際上已絕大部分是MUC13抗性基因豬的性能表現。

表3 生長性能測定結果

2）對MUC13不同基因型仔豬進行生長性能測定對比，雖然易感純合基因型AA豬只達100 kg體重日齡較抗性純合基因型GG豬平均增加1.56 d，背膘厚也平均增加0.36 mm；易感雜合基因型GA豬只達100 kg體重日齡較抗性純合基因型GG豬只平均增加1.34 d，背膘厚也平均增加0.27 mm，但經SPSS統計分析，均未達到顯著水平（P＞0.05），說明MUC13各基因型豬只間在生長速度和活體背膘上沒有顯著差別。

3）由于MUC13易感基因A頻率較低，易感基因純合（AA）豬只數量更少，代表性相對較弱，有待于擴大檢測和性能測定群體以進一步驗證；試驗僅對生長速度和活體背膘進行比較分析，至于其余生產性能指標有無影響也有待后續試驗加以研究。

［1］ Hejun Li，Yuhua Li，Xiaotian Qiu，et al.Identification and Screening of Gene（s）Related to Susceptibility to Enterotoxigenic Escherichia coli F4ab/ac in Piglets［J］.Asian-Aust J Anim Sci，2008，21（4）：489-493.

［2］ 劉鑫.豬腸毒素大腸桿菌（ETEC）F4受體相關候選基因的篩選與表達研究［D］.長沙：湖南農業大學博士學位論文，2008.

［3］ Ren J，Tang H，Yan X M，et al.A pig-human comparative RH map comprising 20 genes on pig chromosome 13q41 that harbours the ETEC F4ac receptor locus［J］.Journal of Animal Breeding and Genetics，2009，126：30-36.

［4］ 阮國榮，肖石軍，徐盼，等.福建省商業豬種MUC13、IGF2和RYR1基因主效位點的遺傳變異分析［J］.江西農業大學學報，2012（已接受）.

［5］ Guorong Ruan，Yuyun Xing，Yin Fan，et al.Genetic variation at five loci of RYR1，IGF2，FUT1，MUC13 and KPL2 affecting economically important traits in Chinese commercial pig breeds［J］.Czech journal of animal science，2012（Accepted）.