兩相一體式污泥濃縮消化反應器運行效能及其微生物特性

何 強,孫興福,艾海男,劉鴻霞,李茂林 (重慶大學三峽庫區生態環境教育部重點實驗室,重慶 400045)

兩相一體式污泥濃縮消化反應器運行效能及其微生物特性

何 強*,孫興福,艾海男,劉鴻霞,李茂林 (重慶大學三峽庫區生態環境教育部重點實驗室,重慶 400045)

為考察兩相一體式污泥濃縮消化反應器(TISTD)的處理效能和影響因素,試驗研究了反應器在不同污泥投配率下的運行效能,并通過顯微鏡、掃描電鏡觀察污泥中微生物的形態和種類,同時通過厭氧培養和分離,以或然計數法(MPN)確定優勢菌株,用16S rDNA測序分析及系統發育分析研究優勢菌株.結果表明,在中溫條件 35℃±2℃下,TISTD反應器最佳污泥投配率為 30%,在此投配率下,排泥含水率達到92.1% ,VS/TS0.2～0.25,產氣量為40.35L/d;污泥顯微鏡觀察結果顯示,有各種形態的變形蟲、豆形蟲、鞭毛蟲和纖毛蟲等原生動物,內反應器污泥電鏡掃描照片顯示包括各種絲狀菌、桿狀菌、球狀菌以及體積較大的菌膠團,污泥中的微生物種群表現出高度的多樣性;16S rDNA序列分析及系統發育樹分析結果顯示,外反應室的優勢菌分屬芽孢桿菌屬,證明外反應室的反應處于產氫產乙酸階段,是污泥水解酸化的主要場所;內反應室的優勢菌分屬于甲烷螺菌屬,證明內反應室是適合產甲烷菌生長并產氣的主要場所,從而實現了污泥同時濃縮消化的生物相分離.

污泥；濃縮消化；TISTD反應器；微生物特性

針對傳統的污泥厭氧處理工藝存在的負荷低、消化時間長、投資費用高等問題,開發新的高效、低耗的污泥厭氧工藝非常迫切[1-4].基于沉降動力學和生物反應動力學等理論,本課題組研發了新型兩相一體式污泥濃縮消化反應器(TISTD),該反應器的主體是由外應室、內反應室和三相分離器 3個部分組成,實驗室試驗及中試試驗證明,該反應器具有良好的污泥濃縮消化功能,消化效果優于普通濃縮池、消化池[5-10].

本質上看,TISTD反應器依然遵循厭氧消化過程的3階段理論,其處理效能高低直接同反應器中微生物有關,而微生物之間既協同作用,又相互影響、制約[3,11-16].TISTD反應器中有兩種關系極為密切的功能菌群:產酸菌群和產甲烷菌群,產酸菌將有機物轉化為揮發性有機酸,而產甲烷菌利用這些有機酸轉化為甲烷、二氧化碳等氣體從而實現污泥的減量化[17-20].在這個過程中,對于污泥消化來說,這2類菌群之間必須達到某種平衡才可使反應器的運行處于一種穩態,但是這2類菌群之間的平衡是脆弱的,這是由于2種微生物在生理學、營養需求、生長速度及對周圍環境的敏感程度等方面存在較大的差異[21-23].

本研究從微生物學角度出發,探索TISTD反應器在最優工況下反應器內微生物的分布特性及優勢菌屬,為進一步優化TISTD反應器系統結構與運行參數、提高污泥處理效能提供微生物學理論基礎.

1 材料與方法

1.1 TISTD的控制與運行

本反應器由外反應室、內反應室、沉淀出水區、污泥壓縮區及集氣室5部分組成(圖1).外反應室與內反應室下部通過水孔相連接,頂部連接三相分離器,表1所列數據為本反應器的主要結構參數[9].

表1 TISTD反應器的構造參數Table 1 Construction parameters of TISTD

試驗污泥取自重慶市雞冠石污水處理廠二沉池,由外反應室的底部進入,在外反應室完成初步濃縮和水解酸化過程后沉降,沉淀下來的污泥經過底部過水孔進入內反應器,在內反應器里進行濃縮消化處理,然后經由三相分離器實現氣水、泥水的分離,消化污泥由反應器底部排出,沼氣由氣液分離器頂部經洗氣瓶和濕式氣體流量計計量后排出,上清液由反應器出水區排至計量水箱測定體積后排出[8].

圖1 TISTD反應器剖面及運行原理Fig.1 Cutaway view and treatment principle of the TISTD

接種污泥取至初沉池,污泥接種量為 50L,當天進二沉池污泥 20L,對接種污泥進行馴化,并逐漸升高反應器內的溫度至35℃左右(1℃/h),之后把溫度控制在 35℃±2℃.每天按照投配率的10%即 11L加入剩余污泥以間歇進泥,間歇排水和間歇排泥的方式進行繼續培養馴化.初期不排泥,在運行了大約28d時,反應器的產氣穩定,排泥含水率、VS/TS以及產氣量達到較為穩定水平,表明反應器內形成了較為穩定的微生物種群結構,即完成反應器的啟動.然后在保持溫度不變,每天(24h)攪拌4次,每次攪拌時間30min下,控制反應器使之在污泥投配率分別為 20%、30%、40%、50%(即污泥的投加量分別為 22,33,44, 55L/d)時達到穩定運行狀態,即反應器在該投配率條件下產氣穩定,排泥含水率、VS/TS達到相對穩定水平,每個階段在效果穩定一周后提高投配率進入下一運行階段[10].

1.2 分析項目及方法

每24h在反應器中下部的取樣口取樣一次,污泥含水率、COD以及VS/TS的測定,采用國際標準方法[24];產氣量采用濕式氣體流量計,pH值直接用哈希pH測定儀;揮發性有機酸(VFA)的分析采用碳酸鹽堿度-VFA聯合滴定法[25].

1.3 厭氧菌株的分離和培養

取1g污泥樣品,在厭氧條件下,采用10倍梯度稀釋法, 無菌移液管取稀釋液 0.5mL加入平板, 無菌刮涂布后于恒溫(35℃±2℃)、厭氧條件下培養待用.

微生物的培養用厭氧工作站(Bugbox,英國Ruskinn公司),供氣采用H2-CO2混合氣體(體積比 4:1).采用甲烷菌培養基和厭氧產酸菌培養基兩種培養基分別、同時同條件下培養[26],培養基的配制方法參考 Hungate[27]和孫征等[28]的方法,微生物計數采用或然數法(MPN法)[29].培養基的配方如下:產甲烷菌:乙酸 3.5g,甲醇 3.5g,磷酸二氫鉀0.4g,磷酸氫二鉀0.4g,氯化鎂0.1g,氯化銨1g,酵母汁1g,水1000mL.另外加入還原劑L－半胱氨酸和指示劑刃天青,使用前每5m1加入3%硫化鈉0.lmL,pH7.0.

厭氧產酸菌:磷酸氫二鉀0. 4g,氯化銨1g,酵母膏1g,氯化鎂1g,葡萄糖8g,氯化鈉1g,1%溴甲酚紫指示劑 5mL,L－半胱氨酸和氧化還原指示劑刃天青, 水1000mL,pH7.0～7.2.

1.4 16S rDNA V3區擴增與TGGE電泳

用于16S rDNA擴增的PCR反應引物為通用引物:正向引物 8F:AGAGTTTGATCCTG GCTCAG;反向引物 1495R:CTACGGCTACCT TGTTACGA.采用菌落PCR方法.

模板制備:用接種針挑取少量單菌落至30μL滅菌超純水(盛放在 PCR管中),置于 PCR儀中98℃加熱 5min,再轉移到 1.5mL離心管中以8500r/min離心10min.上清液轉移出來作為模板備用.

PCR反應體系的組成和反應條件如下:總反應體積為25μL,其中含16μL雙蒸水,2.5μL Buffer (含 Mg2+),引物稀釋到 10pmol/uL,P1和 P2各1μL,DNA模板2μL,2U Taq聚合酶(鼎國生物技術有限公司).以TE取代模板DNA做空白對照.溫度設置:95℃預變性5min;94℃變性1min;56℃退火1min;72℃延伸1min30s,共35個循環,最后72℃延伸10min結束反應.所得產物由瓊脂糖電泳檢測,經切膠回收、PCR擴增、TGGE鑒定后送交測序公司進行測序.

2 結果與討論

2.1 TISTD反應器的運行效果

pH值、揮發性有機酸(VFA)是厭氧消化過程中重要的影響因素,并且揮發性脂肪酸(VFA)是厭氧消化過程的重要中間產物.根據甲烷發酵3階段理論,有72%的甲烷來自乙酸的裂解,只有28%的甲烷來自H2的氧化和CO2的還原,而乙酸大部分是由產酸菌氧化乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等VFA而生成.運行良好的厭氧消化反應器,其VFA濃度應小于500mg/L,最好是低于300mg/L[30].由圖2可見,反應器內部的pH值和VFA在每次提高投配率之后的2d,其變化的幅度都非常大,即VFA突然大幅增加, pH值大幅降低,之后又趨于平穩.但基本上都在厭氧消化需要控制的范圍之內,2～3d之后又趨于平穩.說明本反應器在設計工況下運行狀況良好,具有抵抗沖擊負荷的能力,能夠滿足厭氧消化的需要.總體上來看,外反應室的pH值較內反應室低,外反應室pH 6.65～7.05,內反應室的pH 6.9～7.5;相應地,外反應室的VFA濃度要高于內反應室,外反應室的VFA濃度的平均值大約在380mg/L左右,內反應室的VFA濃度的平均值約在290mg/L.根據厭氧消化的3階段理論分析,可能的原因是外反應室的條件利于水解酸化菌群和產酸菌群的生長繁殖而導致有機酸大量積累,是污泥水解酸化的主要場所;內反應室的有機酸被微生物降解,導致有機酸濃度降低pH值升高,是產甲烷的主要場所.

從圖3可以看出,隨著投配率的增大,反應器排泥含水率未呈現規律性變化,當投配率為 20%的時候,排泥含水率反而有所降低,平均含水率達到 89.3%,之后隨著投配率的增加,排泥含水率急劇的升高.在達到設計水平的投配率下時,排泥平均含水率為 92.1%,可以認為反應器對30%的投配率仍具有較好的濃縮結果,特別是對于沒有污泥脫水設施的小型污水處理廠,有利于污泥的直接干化處理.投配率為40%的時候,排泥平均含水率為 95.5%,仍然較一般的污泥消化池的排泥低,且此狀態下的污泥不失流動性,對于有污泥脫水處理設施的污水處理廠而言,可參照此參數運行.當投配率再提高時,排泥含水率增大,反應器的處理效能已接近普通消化池.可以認為是超出了反應器最大承受能力了,導致反應器內的微生物生態系統紊亂甚至崩潰.

圖2 反應器污泥在運行期間的pH值與VFA變化Fig.2 Change of pH and VFA during operating stage

由圖 3可以看出,投配率￡30%的時候,反應器的進泥 VS/TS 0.53～0.77,排泥含水率穩定在0.2～0.25;當投配率為 40%時,進泥 VS/TS 0.58～0.78,出泥的VS/TS值已經上升至0.3～0.45;當投配率為 50%時,進泥 VS/TS 0.51～0.70,出泥的VS/TS值逐漸變為0.38～0.44.從VS/TS的變化可以看出,30%的投配率是反應器運行的一個拐點,對于 30%以下的投配率反應器有著穩定運行、消化良好的試驗效果,對于30%以上的投配率,污泥消化效果較差.

由圖3可知,當投配率小于30%時候,每天的產氣量與投配率為線性關系,投配率繼續增加,每天的產氣量增幅減少,甚至出現了降低的情況,如在投配率為50%的時候,產氣量為43.62L/d,而投配率為40%的時候,產氣量為44.57L/d.同時,當投配率小于等于30%時,每m3污泥的平均產氣量與投配率呈現明顯的線性關系,投配率再增加,每立方米污泥的平均產氣量由1.21m3下降至0.8m3.2個產氣量曲線在 30%的投配率前都是近似的線性關系說明,隨投配率的提高反應器內易被厭氧降解的基質相應增加,因而厭氧產酸菌和產甲烷菌迅速增殖使產氣量呈線性增加;當投配率達到一定到程度(投配率高于 30%)后,每天的產氣量幾乎不變,但是每天的進泥量卻在增加,所以單位污泥的產氣量下降.分析可能的原因是,隨著投配率的進一步增加,反應器內易降解的有機質大幅增加而致使產酸菌過量繁殖,導致VFA過量積累,最終抑制了產甲烷菌的活性,所以在投配率高于30%時繼續提高污泥投加量,產氣量不再增加或上升反而有下降的趨勢.

圖3 不同投配率下反應器產氣量、污泥含水率和VS/TS變化Fig.3 Treatment efficiency variety curve of reactor in different stable operating stage

研究結果表明,TISTD反應器內的微生物種群在投配率為 30%時,呈現一個較好的生態平衡狀態,即整個反應器內的微生物與環境之間、微生物各種群之間達到高度的適應、協調與統一的狀態.當低于30%的投配率時,系統中多種微生物的生長、代謝與繁殖所需的有機質不足,致使種群數量較少,種群結構不穩定,此時反應器處理效能低、產氣量低且不穩定、抗沖擊負荷能力低.投配率過高,易被微生物降解的有機物過剩,水解酸化菌群和厭氧產酸菌群密度急劇增加,揮發性有機酸大量積累,產甲烷菌群的活性被抑制,直至TISTD反應器內厭氧消化過程中微生物種群結構的平衡狀態被打破,污泥的厭氧消化趨于停滯狀態,反應器的處理效能反而不高.

2.2 微生物形態觀察及細菌群落計數

圖4 TISTD系統外部反應室污泥光學顯微鏡照片(×400)Fig.4 Optical microscope photographs of sludge in the outer reaction chamber of TISTD(×400)

在最優工況下,分別取內外反應器污泥做光學顯微觀察和電鏡掃描.從圖4可以看到,外反應室的污泥微生物種類較多,有各種形態的草履蟲、豆形蟲和纖毛蟲等原生動物,呈團狀存在或零星分布,而內反應室污泥在光學顯微鏡下幾乎觀察不到微生物,分析可能的原因,一是因為內反應室的微生物種群由于細胞個體太小,在光學顯微鏡下無法看見;二是因為內反應室處于嚴格的厭氧條件,在外反應室中的原生動物無法在內反應室中適應、生存.圖 5中的(a)(b)(c)(d)分別為同一時期內反應室污泥的不同樣品的掃描電鏡圖片,可以看出,內反應室污泥中菌群種類復雜,各種形態的細菌互營互生,菌絲交錯相互結合形成了復雜的菌群結構,細胞形態包括球狀、桿狀等,有許多菌膠團存在.

圖5 TISTD反應器內部反應室污泥微生物電鏡掃描鏡照片(′15000)Fig.5 Sludge microorganisms by SEM micrograph in inner TISTD reactor(′15000)

圖6 厭氧分離純化的優勢菌株光學顯微鏡照片(′400)Fig.6 Photographs of predominant strains by optical microscope(′400)

表2 內外反應器中菌落計數結果Table 2 Colony counting results of reactor

圖6中分離培養的厭氧菌株包含的形態也呈多樣性分布,得到的菌株形態比較整齊一致,純化結果較好.說明了厭氧工作站為厭氧微生物的培養提供了良好的條件,可以進行厭氧細菌的計數分析.但從表3中可以看出, 采用稀釋活菌落計數法,發現反應室中厭氧細菌數量并不高.這很可能是由于反應室中許多細菌屬于未培養微生物.

經分離純化培養,從系統內反應室污泥中分離純化選出 20株細菌,分別標號為:內反應室,N1～N10;外反應室,W1～W10.經菌落計數(表3),其中數量最多的只有 6株,編號為 N4,N5,N6, W3,W4,W9.這說明反應器系統在最佳投配率(30%)階段可分離培養得到的優勢菌株數量不多,可能還存在較多的未培養菌株維持反應器運行的功能.結果表明,TISTD反應器中的可培養的微生物種群大部分為厭氧消化過程中的厭氧和兼性厭氧功能種群,為其良好的處理效能提供了主要支撐.

2.3 優勢菌株的16S rDNA序列測定及系統發育分析

圖7可見,菌落電泳條帶較清晰明顯,亮度較高,不含特異性條帶,無拖帶現象,不含引物二聚體,可以用以后續的測序研究.

6株優勢菌(N4,N5,N6,W3,W4,W9)經切膠回收、PCR擴增、TGGE鑒定和送交測序后得到3株菌(W3、W9、N4)的 16S rDNA序列.使用MEGA 4軟件包對測得3株優勢菌的序列進行了系統發育分析,建立系統發育樹,見圖8.

圖7 優勢菌株的DNA瓊脂糖電泳圖譜Fig.7 Agarose gel electrophoresis of dominant strains

經過對W3、W9、N4 3株優勢菌株16S rDNA序列分析及系統發育樹分析,W4、W9菌株和芽孢桿菌屬(Bacillus)的同源性較好,在 98%以上,N4菌株和甲烷菌屬(Methanospirillum)的同源性較好,在97%以上.可以初步鑒定W4和W9是芽孢桿菌屬,N4是甲烷螺菌屬(Methanosp irillumhungatei).其中W4和W9菌株是在外反應室獲得,根據表2的結果,這2株菌株是外反應室的數量最多的 2類菌株,其數量分別為 1.3×105和1.2×105,說明W4和W9是外反應室中起主要作用的功能菌株;結合圖2和圖3,證明外反應室是水解酸化階段的主要場所;同理,N4菌株是在內反應室獲得,證明內反應室是適合產甲烷菌生長并產氣即污泥厭氧消化的主要場所.因此,反應器能培養厭氧和兼性厭氧的產甲烷菌群,并且能有效的實現污泥厭氧消化過程中的生物相分離.

圖8 優勢菌株16S rDNA序列系統發育樹Fig.8 16S rDNA sequence phylogenetic tree of Strain of dominantStrain

3 結論

3.1 在中溫條件下,通過實驗確定了TISTD反應器的最佳投配率為30%,在此投配率下,排泥平均含水率為 92.1%,VS/TS0.2～0.25,產氣量為40.35L/d.TISTD實現了在一個反應器內同時濃縮和消化,且污泥濃縮和消化的效果明顯好于普通的濃縮池和消化池.

3.2 通過對反應器內污泥的觀察,可以看到系統中的微生物種類繁多.光學顯微鏡可以看到外反應室存在變形蟲、豆形蟲、鞭毛蟲和纖毛蟲等眾多原生動物;通過電鏡掃描可以看到內反應室菌群種類復雜,各種形態的細菌互營互生,菌絲交錯相互結合形成了復雜的菌群結構,細胞形態包括球狀、桿狀等,有許多菌膠團存在.

3.3 通過厭氧分離和培養得到的優勢菌株在光學顯微鏡下包括各種形態,如短桿狀、絲狀和球狀.其中3株優勢細菌經序列分析鑒定分別為芽孢桿菌屬和產甲烷菌屬,表明反應器實現了兩相的分離.

3.4 通過使用MEGA 4軟件包對測得3株優勢菌的序列進行了系統發育分析,初步確認了污泥濃縮消化優勢菌株的種類.證明TISTD反應器有效的實現了污泥厭氧消化過程中的生物相分離,外反應室的優勢菌群是芽孢桿菌屬,是污泥濃縮酸化主要場所,內反應室的優勢菌群是古細菌和甲烷菌屬,是污泥消化產甲烷的主要場所.

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Operation efficiency and microbial characteristics of two-phase integrated sludge thickening and digestion reactor.

HE Qiang*, SUN Xing-fu, AI Hai-nan, LIU Hong-xia, LI Mao-lin (Key Laboratory of the Three Gorges Reservoir Region’s Eco-Environment, Ministry of Education, Chongqing University, Chongqing 400045, China). China Environmental Science, 2012,32(11)：2039～2046

An experimental study was conducted to investigate the treatment efficiency and impact factors of TISTD reactor. The treatment efficiency was investigated in different sludge dosage rate, besides, the shape and type of the microbe in sludge was observed by microscope and SEM, at the same time, MPN method was applied to determine the predominant strains by anaerobic culture and separation, and then 16S rDNA sequencing and phylogenetic analysis was used to study the predominant strains. The results showed that under mid-temperature(35℃±2℃) condition, the best sludge dosage rate was 30%, and the sludge organic matter decomposition rate and discharged sludge moisture content could be up to 65.09% and 92.09% respectively under the best condition. The microscopy results showed that there was a variety of different shaped Amoeba, Colpidium, Flagellates,Ciliates,and some other protozoa in the sludge and the SEM photos showed that the sludge contains variety of filamentous, bacilliform spherical bacteria , fungus, and the relatively larger size zoogloea, which demonstrated TISTD reactor had a high biodiversity in microbial communities. 16S rDNA sequence analysis and phylogenetic tree analysis proved that the outer chamber reaction was in hydrogenesis and acetogenesis stage and was the main places of sludge hydrolysis and acidification for that the Bacillus was the predominant microbial community while the within chamber was suitable for the growth of methanogens and gas production , which was the main place to achieve the biological sludge thickening and digestion separation for that Methane Spirillum or Archaea was the predominant microbial community.

sewage sludge；thickening and digestion；TISTD reactor；microbial characteristics

2012-03-20

水體污染控制與治理科技重大專項(2009ZX07315-002)

* 責任作者, 教授,hq0980@126.com

X172

A

1000-6923(2012)11-2039-08

何 強(1965-),男,江蘇江陰人,教授,主要從事水污染控制理論與技術研究.發表論文80余篇.