利用剩余污泥水解酸化液合成聚羥基脂肪酸酯的研究

盛欣英 ,熊惠磊 ,孫 潤(rùn) ,陳國(guó)強(qiáng) ,施漢昌 ,張慶竹 ,王 慧 * (.山東大學(xué)環(huán)境研究院,山東 濟(jì)南5000；.清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院,北京 00084；.清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 00084)

利用剩余污泥水解酸化液合成聚羥基脂肪酸酯的研究

盛欣英1,2,熊惠磊2,孫 潤(rùn)2,陳國(guó)強(qiáng)3,施漢昌2,張慶竹1,王 慧2*(1.山東大學(xué)環(huán)境研究院,山東 濟(jì)南250100；2.清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院,北京 100084；3.清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100084)

以城市污水處理廠剩余污泥水解酸化產(chǎn)物為原料,研究了羅氏真養(yǎng)菌(Ralstonia eutropha)H16在水解酸化液中的生長(zhǎng)規(guī)律和聚羥基脂肪酸酯(PHAs)積累特性,同時(shí)分析了H16對(duì)水解酸化液中各種有機(jī)酸組分的利用規(guī)律. 結(jié)果表明,以剩余污泥52℃中溫水解酸化48h的水解酸化液為培養(yǎng)基,在HAc水解酸化液(C/N/P=100/10/1, TOC＝2881mg/L,乙酸占總有機(jī)酸含量36.1%)中,H16最先利用乙酸和正丁酸來(lái)進(jìn)行自身的生長(zhǎng)和PHAs的合成,合成的主要產(chǎn)物是聚羥基丁酸酯(PHB);隨后開(kāi)始利用丙酸和正戊酸,在此過(guò)程中聚羥基戊酸酯(PHV)的含量也逐步上升,菌體量同步增長(zhǎng), H16在40h左右處于平穩(wěn)期,并且達(dá)到最大積累率為12.51%(占菌體干重);最后利用的是異丁酸和異戊酸,但是此時(shí)H16已經(jīng)進(jìn)入衰亡期,菌體量和PHAs合成率都在下降.當(dāng)以HVa水解酸化液(C/N/P=100/10/1, TOC＝2358mg/L,異戊酸占總有機(jī)酸含量29.0%)為培養(yǎng)基時(shí), H16在18h達(dá)到生長(zhǎng)的峰值,24h達(dá)到PHAs合成率的最大值為32.14%(占菌體干重),PHV為PHAs的主要形式.

聚羥基脂肪酸酯(PHAs)；羅氏真養(yǎng)菌H16；剩余污泥；水解酸化液；揮發(fā)性有機(jī)酸(VFAs)

聚羥基脂肪酸酯(PHAs)是一種生物聚酯,是由微生物在不平衡的生長(zhǎng)條件下,如氮、磷、硫等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏而碳源相對(duì)過(guò)剩,在微生物體內(nèi)合成的胞內(nèi)碳源和能源儲(chǔ)藏性物質(zhì).PHAs不但擁有與聚乙烯、聚丙烯等石油化工產(chǎn)品相似的熱塑性與力學(xué)性能, 而且能夠被許多微生物利用自身分泌的PHAs解聚酶降解.因此,作為最新一代生物可降解塑料,PHAs可以取代污染日益嚴(yán)重的石油化工塑料,同時(shí)在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、精細(xì)化工等方面也有著極高的應(yīng)用價(jià)值,具有良好的應(yīng)用前景和巨大的經(jīng)濟(jì)效益[1-4].

微生物合成PHAs可利用的碳源有很多,如碳水化合物(葡萄糖、蔗糖等)、醇類(lèi)(甲醇、乙醇等)、有機(jī)酸(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、乳酸等)[5-6].其中,短鏈有機(jī)酸(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等)可以通過(guò)厭氧條件下將剩余污泥、食品、農(nóng)業(yè)廢物等進(jìn)行水解酸化來(lái)獲得,這不但使廢物資源得到利用,實(shí)現(xiàn)剩余污泥的減量化、資源化,并且可以有效地降低PHAs的生產(chǎn)成本[7-8],因此利用污泥生產(chǎn)PHAs成為研究熱點(diǎn).

羅氏真養(yǎng)菌(Ralstonia eutropha)能夠利用各種碳源合成PHAs,關(guān)于該菌株在營(yíng)養(yǎng)限制條件下(如限氮或限磷等)利用葡萄糖、實(shí)驗(yàn)室配制的單一或者混合有機(jī)酸為碳源積累PHAs的研究有很多[9-10],但該菌株以水解酸化液為碳源合成 PHAs的研究尚未有報(bào)道.本課題組在研究剩余污泥資源化過(guò)程中獲得了分別以乙酸和戊酸為主要有機(jī)酸組分的 2種水解酸化液,本文研究了羅氏真養(yǎng)菌 H16利用剩余污泥厭氧水解酸化產(chǎn)物合成PHAs的過(guò)程,以及對(duì)水解酸化液中各種揮發(fā)性有機(jī)酸(VFAs)和其他溶解性有機(jī)物的利用規(guī)律,探索PHAs的積累特性與水解液中各種有機(jī)酸消耗的關(guān)系,旨在為開(kāi)發(fā)城市污水廠剩余污泥減量及資源化技術(shù)提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 羅氏真養(yǎng)菌(Ralstonia eutropha H16,以下簡(jiǎn)稱(chēng)H16),由清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供.

1.1.2 培養(yǎng)基 礦物培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,氯化銨0.5,硫酸鎂0.2,十二水合磷酸氫二鈉9.65,磷酸二氫鉀1.5,微量元素溶液I 10mL/L,微量元素溶液II 1mL/L.

微量元素溶液I(g/L): 檸檬酸鐵銨5,二水合氯化鈣2.

微量元素溶液 II(g/L):七水合硫酸鋅 0.1,四水合氯化錳0.03,硼酸0.3,六水合氯化鈷0.2,五水硫酸銅 0.01,六水合氯化鎳 0.02,二水合鉬酸鈉0.03.

LB培養(yǎng)基(g/L):酵母粉5,蛋白胨10,氯化鈉5. 1.1.3 水解酸化液制備 將剩余污泥的厭氧消化水解控制在產(chǎn)酸階段,可以獲得富含揮發(fā)性脂肪酸的發(fā)酵液,以下簡(jiǎn)稱(chēng)水解酸化液.在水解罐中,加入取自北京市小紅門(mén)污水處理廠二沉池的污泥,在 52℃下中溫水解酸化 48h后排泥,4℃10000r/min,離心 30min后取得上清液.通過(guò)控制水解酸化的條件(此部分成果待發(fā)表),獲得了分別以乙酸(HAc)和戊酸(HVa)為主要 VFAs組分的水解酸化液,2種水解酸化液中有機(jī)酸的組分如表1所示.

表1 不同條件獲得的水解酸化液的成分Table 1 Compositions of AFL obtained in different fermentation conditions

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 菌種活化 -80℃凍存的 H16菌種于20mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h,然后按10%接種量于100mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,之后按照10%接種量于礦物培養(yǎng)基中培養(yǎng) 48h后作為實(shí)驗(yàn)用種子液.搖床條件均為150r/min、30℃.

1.2.2 搖瓶培養(yǎng) 控制接種量使得初始培養(yǎng)基中菌體生物量為0.3g/L,接種于2種水解酸化液中培養(yǎng)60h,每種水解酸化液設(shè)置3個(gè)平行樣.在培養(yǎng)過(guò)程中定時(shí)取樣測(cè)定VFAs、TOC、菌體生物量(DCW)、PHAs等指標(biāo).

1.3 檢測(cè)與分析方法

1.3.1 細(xì)胞干重(DCW)測(cè)定 菌體于 4℃10000r/min,離心 10min,生理鹽水洗滌 2次,于-50℃下真空冷凍干燥24h[11].

1.3.2 VFAs測(cè)定 培養(yǎng)過(guò)程中取得的菌液4℃10000r/min,離心 2min,去除大部分菌體后,經(jīng)過(guò)0.22mm膜過(guò)濾,調(diào)pH＜2,進(jìn)行氣相色譜(HP-6890)分析[12].

1.3.3 PHAs含量測(cè)定 稱(chēng)取一定量冷凍干燥菌體于酯化罐中,加入2mL氯仿、1mL酯化液(甲醇90%、濃硫酸10%、10g/L苯甲酸內(nèi)標(biāo))于100℃反應(yīng)4h,冷卻后加入1mL水,震蕩、靜置、分層,取下層有機(jī)相進(jìn)行氣相色譜(島津 GC-2014)分析[13].

2 結(jié)果與討論

2.1 菌體生長(zhǎng)、有機(jī)質(zhì)利用與PHAs合成

圖1 HAc水解酸化液中TOC降解與菌體生長(zhǎng)規(guī)律Fig.1 Evolution of TOC and cell growth of H16 in AFL containing a major VFA of acetic acid

由圖1～圖3可見(jiàn),0～20h,菌體的生長(zhǎng)非常迅速,DCW迅速增加,PHAs也迅速合成,同時(shí)TOC迅速降低,但培養(yǎng)基中的 VFAs/SCOD沒(méi)有顯著變化,說(shuō)明培養(yǎng)基中的VFAs和其他非VFAs碳源被同時(shí)利用. 20～40h,菌體表現(xiàn)為生長(zhǎng)和 PHAs積累同步進(jìn)行,菌體的增加量沒(méi)有0～20h顯著,但PHAs的產(chǎn)率與0～20h基本相同;這時(shí)TOC仍保持隨時(shí)間降低的趨勢(shì),但VFAs/SCOD降低更快,說(shuō)明H16在20～40h內(nèi)VFAs的利用高于非VFAs的利用. Fernando等[19]在研究高壓堿熱解處理剩余污泥獲得堿熱解液中也發(fā)現(xiàn),活性污泥微生物利用其中非 VFAs部分的碳源進(jìn)行自身生長(zhǎng),利用VFAs部分的碳源進(jìn)行PHA積累.在本研究中也觀察到了當(dāng)非 VFAs碳源大量消耗時(shí),菌體量有顯著增加的現(xiàn)象.40～60h,雖然其菌體量基本不變,水解酸化液中的TOC不再下降, VFAs/SCOD的比例也基本不變,而菌體 PHAs合成率卻在急劇下降,這說(shuō)明H16已經(jīng)將水解酸化液中可利用的碳源基本利用完畢,而開(kāi)始利用自身儲(chǔ)藏的碳源PHAs進(jìn)行維持正常的生命活動(dòng).

圖2 HAc水解酸化液中VFAs/SCOD變化與菌體生長(zhǎng)規(guī)律Fig.2 Evolution of VFAs/SCOD and cell growth of H16 in AFL containing a major VFA of acetic acid

圖3 HAc水解酸化液中PHAs積累與菌體生長(zhǎng)規(guī)律Fig.3 PHAs accumulation in H16 during cell growth in AFL containing a major VFA of acetic acid

2.2 H16對(duì)HAc水解酸化液中VFAs的利用與PHAs的積累

不同的水解酸化條件產(chǎn)生的水解酸化液的組成和含量會(huì)有很大不同[14].而菌株對(duì)不同VFAs的利用效率以及合成PHAs的種類(lèi)也是不同的[15-18].因此,本文研究了H16對(duì)HAc水解酸化液中不同 VFAs利用隨時(shí)間的變化情況,同時(shí)探究了VFAs的變化與合成的PHAs的種類(lèi)之間的關(guān)系.

圖4 HAc水解酸化液中各組分隨時(shí)間變化Fig.4 Evolution of the concentrations of different VFAs in AFL containing a major VFA of acetic acid

由圖4可見(jiàn),0～20h,6種VFAs都在消耗,但乙酸和正丁酸利用的更快,消耗也更多;20～40h,丙酸和正戊酸的消耗逐漸加快,異戊酸和異丁酸的消耗相對(duì)緩慢,至 50h左右基本利用完畢.這說(shuō)明H16對(duì)HAc水解酸化液中6種酸的利用是有先后順序的,分別是:乙酸、正丁酸、丙酸、正戊酸、異丁酸、異戊酸,利用規(guī)律是先短鏈后長(zhǎng)鏈、先直鏈后支鏈. H16以HAc水解酸化液為培養(yǎng)基合成PHAs的組成結(jié)構(gòu)和單體的相對(duì)含量如表2所示.

表2 不同時(shí)間內(nèi)的H16合成PHAs的組成結(jié)構(gòu)和單體相對(duì)含量Table 2 PHAs content in H16 and monomer compositions of the PHAs in AFL containing a major VFA of acetic acid

由表 2可知,由于乙酸和正丁酸的快速消耗,0～20h時(shí)主要合成的是PHB,占PHAs含量的86.50%,同時(shí)合成一定量的 PHV.20～30h時(shí),乙酸含量繼續(xù)降低,正丁酸基本用完,合成的 PHB的絕對(duì)含量也繼續(xù)升高;同時(shí)其他種類(lèi)的有機(jī)酸如丙酸、正戊酸等的消耗也逐漸加快,這時(shí)PHV的合成率也開(kāi)始逐步的提高, PHV占PHAs總含量的18.63%.30～40h,乙酸被利用完,PHB的合成量也達(dá)到了最大;丙酸也消耗了絕大部分,異丁酸和異戊酸的消耗增多,PHV的合成率也達(dá)到了最大值,40h菌體的 PHAs合成率達(dá)到了最大值為12.51%.由此可見(jiàn),乙酸、丁酸主要是用來(lái)合成PHB,而丙酸、戊酸等主要是合成 PHV的原料. Akiyama等[20]研究了一株改良的羅氏真養(yǎng)菌分別以 C2～C22等不同鏈長(zhǎng)有機(jī)酸為單一碳源合成PHA的規(guī)律,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株利用偶數(shù)碳的有機(jī)酸主要合成 PHB,利用奇數(shù)碳的有機(jī)酸主要合成PHV.本研究中發(fā)現(xiàn)H16在HAc水解酸化液中也呈現(xiàn)了基本一致的規(guī)律.

在50h時(shí),由于HAc水解酸化液中有機(jī)酸含量已經(jīng)相當(dāng)?shù)土?不足以支持菌體的生長(zhǎng)和PHAs的積累,所以H16的生物量開(kāi)始下降,PHAs積累率下降得更快,說(shuō)明菌體開(kāi)始利用自身貯存的碳源和能源性物質(zhì) PHAs來(lái)維持正常的生命活動(dòng).由表 2可見(jiàn),50h處菌體不再進(jìn)行 PHAs的積累,PHB占總 PHAs含量的 78.89%,PHV占21.11%,PHB比PHV減少的快,這說(shuō)明菌體在利用自身貯存的PHAs進(jìn)行生長(zhǎng)時(shí),也優(yōu)先利用PHB.

由表3可見(jiàn),0～20h與20～40h內(nèi)PHAs的產(chǎn)率基本一致,單位時(shí)間內(nèi)合成的PHAs的質(zhì)量基本相同,但是2個(gè)階段各種有機(jī)酸消耗的規(guī)律卻明顯不同.0～20h菌體生長(zhǎng)更快,單位有機(jī)酸的PHAs產(chǎn)率也較高.相比之下,20～40h H16生長(zhǎng)減慢,單位有機(jī)酸的PHAs產(chǎn)率也較低.對(duì)比這2個(gè)時(shí)間段內(nèi)乙酸的消耗可以看出,20～40h消耗了更多的乙酸卻沒(méi)有產(chǎn)生更多的 PHAs,而是與0～20h的產(chǎn)率基本持平,這說(shuō)明乙酸雖然消耗的快,但并不是都用于PHAs的積累,可能很大一部分用于微生物的生長(zhǎng).而長(zhǎng)鏈的有機(jī)酸如丁酸、戊酸等可能更有利于PHAs的合成,且主要產(chǎn)物為 PHV. Ruan等[21]研究真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌利用乙酸、丙酸、丁酸、乳酸等有機(jī)酸為單一碳源合成PHAs的過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈有機(jī)酸比短鏈有機(jī)酸更有利于合成PHAs. Du等[22]利用乙酸作為共底物加入到壬酸或者辛酸中,可以提高PHAs的產(chǎn)量,并且發(fā)現(xiàn)乙酸本身主要用于細(xì)胞質(zhì)的合成與能量供給.可見(jiàn)由于乙酸容易利用,水解酸化液中的乙酸可能會(huì)對(duì)PHAs的合成有一定的促進(jìn)作用,但乙酸本身并不一定是合成PHAs的最佳碳源.

表3 HAc水解酸化液中PHA產(chǎn)率與有機(jī)酸消耗量的關(guān)系Table 3 Effect of VFAs on PHAs yield in AFL containing a major VFA of acetic acid

2.3 H16在HVa水解酸化液中PHAs的積累

圖5 HVa水解酸化液中TOC、DCW隨時(shí)間變化Fig.5 Change of TOC and cell growth of H16 in AFL containing a major VFA of iso-valeric acid

由表1可見(jiàn),與HAc水解酸化液相比, HVa水解酸化液中各種有機(jī)酸的含量有很大差異, HVa水解酸化液中正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸含量占總有機(jī)酸的 74.4%.本課題組研究發(fā)現(xiàn)該菌株H16在不同水解酸化液中的VFAs利用情況基本同HAc水解酸化液一致.圖5和表4表明,H16在18h開(kāi)始進(jìn)入平穩(wěn)期,TOC的消耗達(dá)到最低值,且基本保持不變,DCW 在此處達(dá)到最高值, 之后逐漸減少.在該水解酸化液中,H16于24h處PHAs合成率達(dá)到最大,為32.14%,顯著高于在HAc水解酸化液中積累率.本研究進(jìn)一步證實(shí)了Ruan等[21]關(guān)于長(zhǎng)鏈有機(jī)酸更有利于PHAs積累的發(fā)現(xiàn). H16在HVa水解酸化液中主要合成的是 PHV,占 PHAs總含量的 80.93%,PHB占19.07%.這一結(jié)果表明H16在水解酸化液中利用戊酸主要合成PHV的結(jié)論.

表4 H16在HVa水解酸化液中PHAs合成情況Table 4 PHAs content and monomer compositions of H16 in AFL containing a major VFA of iso-valeric acid

由此可知,當(dāng)水解酸化液中乙酸含量較高時(shí),由于對(duì)乙酸的快速利用,微生物的生長(zhǎng)較快,但PHAs的積累相對(duì)較慢,PHAs的合成以PHB為主.而當(dāng)水解液中丁酸和戊酸的比例較高時(shí),由于丁酸、戊酸等相對(duì)于乙酸較難利用,所以微生物的生長(zhǎng)明顯減慢,但PHAs的合成則明顯加快,PHAs的合成以 PHV為主.有機(jī)酸組成的不同導(dǎo)致了H16在2種水解酸化液中的生長(zhǎng)量和PHAs組成有較大的差異.

3 結(jié)論

3.1 羅氏真養(yǎng)菌H16能夠有效利用剩余污泥水解酸化液合成 PHAs,有機(jī)酸的組成會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)與PHAs的合成.在HAc水解酸化液中,其PHAs合成率最高為12.51%,合成的PHAs成分主要是PHB;在HVa水解酸化液中,其PHAs合成率最高為32.14%,合成的PHAs成分主要是PHV.

3.2 H16在HAc水解酸化液中有機(jī)酸的利用順序依次為乙酸、正丁酸、丙酸、正戊酸、異丁酸、異戊酸.當(dāng)H16主要消耗乙酸、丁酸時(shí),其合成的PHAs成分主要是PHB;當(dāng)水解酸化液中的丙酸、戊酸開(kāi)始快速消耗時(shí),菌體內(nèi)合成的PHV的百分含量也逐漸增加.

3.3 相對(duì)于HAc水解酸化液,H16在HVa水解酸化液中的菌體生長(zhǎng)明顯減慢,PHAs的合成得到加強(qiáng),HVa中的長(zhǎng)鏈有機(jī)酸更有利于PHAs的合成.

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Polyhydroxyalkanoates production by Ralstonia eutropha H16 fed by waste sludge anaerobic fermentative liquid.

SHENG Xin-ying1,2, XIONG Hui-lei2, SUN Run2, CHEN Guo-qiang3, SHI Han-chang2, ZHANG Qing-zhu1, WANG Hui2*(1.Environment Research Institute, Shandong University, Jinan 250100, China；2.School of Environment, Tsinghua University, Beijing 100084, China；3.School of Life Science, Tsinghua University, Beijing 100084, China). China Environmental Science, 2012,32(11)：2047～2052

Polyhydroxyalkanoates (PHAs) accumulation and carbon consumption by Ralstonia eutropha H16 were investigated in anaerobic fermentative liquid (AFL) of waste activated sludge (WAS). The WAS was fermented at 52℃with a sludge retention time (SRT) of 48 hours in hydrolysis reactor to form AFL, in which the volatile fatty acids(VFAs) were feasible carbon source for PHAs synthesis. When acetic acid was the predominant component of VFAs in the AFL (C/N/P≈100/10/1,TOC＝2881mg/L, acetic acid/total VFAs=36.1%), R. eutropha H16 could utilize acetic acid and n-butyric prior to other VFAs for cell growth and PHAs synthesis, and the major monomer of PHAs was hydroxybutyrate (HB). Propionic and n-valeric acid were utilized at 20～40 hours after inoculation as hydroxyvalerate (HV) monomer content increasing. The maximum PHAs content detected in the cells was 12.51% (dry weight) after 40-hour reaction, and then iso-butyric and iso-valeric acid were utilized but both PHAs synthesis and cell growth decreased. When iso-valeric acid was the predominant VFA in the AFL (C/N/P≈100/10/1, TOC＝2358mg/L, iso-valeric acid/total VFAs=29.0%), the maximum PHAs content detected in the cells was up to 32.14% (dry weight) at 24-hour of growth and hydroxyvalerate (HV) was the major monomer of PHAs.

polyhydroxyalkanoates(PHAs)；Ralstonia eutropha H16；waste activated sludge(WAS)；anaerobic fermentative liquid (AFL)；volatile fatty acids(VFAs)

2012-03-22

國(guó)家水污染治理重大專(zhuān)項(xiàng)資助項(xiàng)目(2009ZX07313-003);清華大學(xué)校自主研究基金項(xiàng)目(2010THZ02)

* 責(zé)任作者, 教授, wanghui@tsinghua.edu.cn

X705

A

1000-6923(2012)11-2047-06

盛欣英(1986-),女,山東青島人,山東大學(xué)環(huán)境研究院碩士研究生,主要從事剩余污泥合成PHAs的研究.